Artículos farmacéuticos
Resumen] Objetivo: explorar el establecimiento de métodos de prueba de límite microbiano para preparaciones antifúngicas azólicas. Objetivo: explorar el establecimiento de métodos de prueba de límites microbianos para preparaciones antifúngicas azólicas. Métodos: A través de experimentos preliminares, se propuso utilizar una solución mixta de histidina, lecitina y polisorbato 80 como diluyente y solución de enjuague, y utilizar el método de recolección de bacterias por sedimentación centrífuga combinado con el método de filtración por membrana para realizar una inspección del límite microbiano en este tipo. de medicamentos, y Se validó la metodología. Resultados: El método propuesto se verificó de acuerdo con los requisitos del apéndice de la versión 2005 de la Farmacopea China. Las tasas de recuperación de las cepas verificadas fueron todas superiores al 70% y las bacterias positivas examinadas por las bacterias de control también crecieron bien. Conclusión: Utilizando una solución mixta de histidina, lecitina y polisorbato 80 como diluyente y solución de enjuague, es factible utilizar el método de recolección de bacterias por sedimentación centrífuga y el método de filtración por membrana para realizar pruebas de límite microbiano en preparaciones de fármacos antifúngicos azólicos.
[Palabras clave] Preparaciones antifúngicas de pirrol; prueba de límite microbiano; método de sedimentación centrífuga; método de filtración por membrana
Los medicamentos antifúngicos de pirrol, como el nitrato de bufaconazol, clotrimazol, etc., tienen un amplio espectro. actividad antifúngica y tiene buena actividad antibacteriana contra Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Escherichia coli, etc. Tiene buena actividad antibacteriana contra Staphylococcus epidermidis, Mucor, Aspergillus, Staphylococcus chromogenes, Cryptococcus y Candida. Estos medicamentos interfieren con la actividad del citocromo P-450, inhiben la biosíntesis de ergosterol, el esterol principal de la membrana celular del hongo, destruyen la membrana celular del hongo y cambian su permeabilidad, lo que conduce a la fuga de importantes sustancias intracelulares y también inhiben la membrana celular del hongo. La biosíntesis de acilglicerol y fosfolípidos inhibe las actividades de la oxidasa y la peroxidasa, provocando la acumulación de peróxido de hidrógeno intracelular, lo que conduce a la degeneración submicroscópica y la necrosis celular de las células. y necrosis celular. Este tipo de fármaco también tiene cierto efecto inhibidor sobre las bacterias. De acuerdo con los requisitos nacionales actuales, el establecimiento de límites microbianos para preparaciones farmacéuticas no estériles incluye medicamentos antibacterianos y antifúngicos. Sin embargo, dado que dichos medicamentos tienen una fuerte actividad antibacteriana, la forma más importante es eliminar sus propiedades bacteriostáticas para que la prueba pueda realizarse sin problemas. punto clave importante y difícil para establecer el método. En este artículo, el autor seleccionó preparaciones de fármacos antifúngicos azólicos (como nitrato de butoconazol y nitrato de butoconazol) como objeto de investigación, nitrato de butoconazol y clotrimazol) para la investigación experimental. Después de muchos experimentos, la atención se centró en el enjuague La composición de la solución y el. Se investigó y optimizó la cantidad de solución de enjuague. Finalmente, se determinó una solución mixta que contenía histidina, lecitina y polisorbato 80 como diluyente y solución de enjuague con referencia a la Farmacopea Europea, y la solución de enjuague se recogió mediante precipitación centrífuga de bacterias. Al combinar el método de recolección de bacterias por sedimentación centrífuga con el método de filtración por membrana, se estableció un método de inspección del límite microbiano para preparaciones farmacéuticas de nitrato de bufaconazol y clotrimazol, y se verificó que el método es aplicable y factible.
1. Medicamentos e instrumentos de prueba
1.1 tipos de medicamentos de prueba
Crema vaginal de nitrato de bufaconazol producida por 3 lotes y 2 fabricantes 3 lotes de tabletas vaginales de clotrimazol, 3 lotes de crema de clotrimazol compuesto, 3 lotes de crema de clotrimazol y 3 lotes de crema de acetato de miconazol son medicamentos disponibles comercialmente: medio de cultivo de caldo nutritivo, medio de Martin modificado, agar nutritivo, agar rosa, sales biliares, medio de lactosa, bromuro de cetilo y bromuro. El medio de lactosa, el medio de agar con bromuro de cetiltrimetilamina y el medio de agar con manitol y cloruro de sodio se adquirieron del Instituto de China para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos; reactivos y reactivos analíticos disponibles comercialmente Staphylococcus aureus [CMCC (B) 26003], Bacillus subtilis [CMCC (B) 63501], Escherichia coli [CMCC (B) )44102], Pseudomonas aeruginosa [CMCC(B)10104], Candida albicans; [CMCC(F)98001] y Aspergillus niger [CMCC(F)98003], las cepas anteriores se adquirieron del Instituto Chino para el Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos. La cámara de semillas se prepara en un tipo bacteriano de verificación de acuerdo con los requisitos de el apéndice de la edición de 2005 de la Farmacopea China. Prepare las cinco bacterias verificadas anteriores en una solución bacteriana que contenga 50 ~ 100 ufc por 1 ml.
1.2 Instrumentos
Mesa de trabajo limpia, aspirador médico, centrífuga de baja velocidad, etc.
2 Métodos y resultados
2.1 Resultados de las pruebas del método del apéndice de la farmacopea
Utilice los medicamentos mencionados anteriormente con el diluyente de uso común (pH 7,0) recomendado por el Edición de 2005 de la "Farmacopea China") para preparar una solución de prueba de 1:10 y utilizar varios métodos de tratamiento para eliminar la inhibición del fármaco en el Apéndice de la Farmacopea en secuencia, es decir, varios métodos para eliminar las propiedades antibacterianas del fármaco en el Apéndice de la Farmacopea. a saber: método de dilución del medio de cultivo (solución de prueba 1:10 (0,2 ml por placa o solución de prueba 1:100 (0,2 ml por placa)), precipitación centrífuga para recolectar bacterias y filtración por membrana con tampón de peptona y cloruro de sodio estéril a pH 7,0. como el método de solución de enjuague y el método de recuento de colonias que combina el método de sedimentación centrífuga para recolectar bacterias y el método de filtración por membrana.
2.2 Determinación de la tasa de recuperación
Incluso si se utilizan el método de sedimentación centrífuga y el método de filtración por membrana con mayor intensidad de procesamiento, la tasa de recuperación de 4 de las 5 cepas verificadas es cero. muestra que la tasa de recuperación del pirroleo es relativamente alta. La tasa de recuperación es cero, lo que indica que los fármacos antifúngicos azólicos tienen un fuerte efecto inhibidor sobre bacterias y hongos, o que la membrana tiene una fuerte capacidad de adsorción para dichos fármacos y es difícil enjuagarlos con soluciones de enjuague de uso común. Adecuado para el tratamiento de este tipo de fármacos.
2.3 Comparación de los efectos de diluyentes y soluciones de lavado de diferentes fórmulas
Con referencia a la edición de 2005 de la Farmacopea China [1] y la 5ª edición de la Farmacopea Europea [2 ], se preparó lo siguiente 5 diluyentes y soluciones de enjuague, ver Tabla 2.
Seleccione un lote de tabletas vaginales de clotrimazol, pruebe los cinco diluyentes y soluciones de lavado anteriores en secuencia y utilice una combinación de método de sedimentación centrífuga y método de filtración por membrana para comparar los efectos experimentales.
Los resultados anteriores muestran que usar la solución de fórmula de la Farmacopea Europea y lecitina reactiva importada, o usar la solución casera No. 5 como diluyente y solución de enjuague, es más efectivo para eliminar el efecto antibacteriano del Sin embargo, cuando se reemplazó la lecitina por un reactivo doméstico, la solución quedó turbia y no se pudo filtrar. Cuando la dosis de lecitina y polisorbato 80 se reduce a la mitad de la fórmula de la Farmacopea Europea, la claridad de la solución no se ve afectada por la calidad de los reactivos y el efecto de enjuague también puede cumplir con los requisitos experimentales. .4 Establecimiento del método
2.4.1 Establecimiento del método De acuerdo con los resultados de la prueba anteriores, tomar 10 g de la muestra de prueba y agregar una solución mixta que contenga histidina-lecitina-polisorbato 80 estéril (Preparación (ver método abajo) a 100 ml, incubar y agitar a 45°C hasta que la sustancia problema esté uniformemente dispersada, y preparar una solución madre uniforme de sustancia problema 1:10. Se utilizaron métodos de sedimentación centrífuga y filtración por membrana para el recuento de bacterias, moho y levaduras. Tome 50 ml de solución madre 1:10, centrifugue a 500 rpm durante 5 minutos, tome todo el sobrenadante, agregue la mezcla anterior a 50 ml, luego centrifugue a 3000 rpm durante 20 minutos, tome aproximadamente 5 ml de solución de recolección bacteriana del fondo, agregue la mezcla anterior a 50 ml para obtener una solución madre 1:10 (el paso de precipitación se puede omitir para cremas y otras preparaciones). Tome 1 ml de la solución de prueba 1:10 y agréguelo a 100 ml de la solución mixta anterior. Filtre todo con una membrana de filtro. Utilice la solución mixta anterior como solución de enjuague, enjuague 100 ml cada vez, enjuague tres veces. y tome la membrana del filtro, inspeccione de acuerdo con la ley (Apéndice XJ de la Parte II de la edición de 2005 de la "Farmacopea China").
2.4.2 Verifique las bacterias de control (como Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, etc.) utilizando el método de recolección de bacterias por sedimentación centrífuga combinado con el método de filtración por membrana. Tome 10 ml de la solución de prueba 1:10 debajo del elemento de conteo de colonias bacterianas anterior, agréguelo a 100 ml de la solución mixta anterior, filtre con una membrana filtrante, enjuague con el mismo método que debajo del elemento de conteo de colonias bacterianas e inocule. la membrana del filtro en el medio de cultivo correspondiente Inspeccione de acuerdo con la ley (Farmacopea China, Parte 2, Apéndice XJ, edición de 2005).
2.4.3 Método de preparación de la solución mixta estéril histidina-lecitina-polisorbato 80: polisorbato 80 15 g, lecitina 1,5 g, histidina 0,5 g, peptona 0,5 g, cloruro de sodio 2,15 g, dihidrógenofosfato de potasio 1,8 g , hidrogenofosfato disódico 3,6 g, agua 1000 ml Mezclar la solución, disolver a temperatura tibia, tomar alícuotas y esterilizar.
2.5 Prueba de verificación
El método anterior se verificó de acuerdo con los requisitos del apéndice de la edición de 2005 de la "Farmacopea China".
2.5.1 Verificación de los métodos de recuento de bacterias, moho y levaduras. Grupo de líquidos bacterianos: tome 1 ml de cada uno de los 5 líquidos bacterianos anteriores y utilice el método de recuento de placas de Petri para determinar las bacterias viables por ml. en el número del líquido bacteriano preparado. Grupo de referencia: tomar 1 ml de la solución de referencia 1:10, agregar 100 ml de la solución mixta anterior, filtrar todo con una membrana filtrante, enjuagar con el mismo método anterior, tomar la membrana filtrante, incubar a la temperatura especificada y contar. Grupo de prueba: Tome 1 ml de solución de prueba 1:10, opere de la misma manera que el grupo de control de prueba, agregue 1 ml de la solución bacteriana anterior (50~100 ufc de bacterias de prueba) en la solución del tercer enjuague, tome el filtro membrana y cultivar a la temperatura especificada, contar y calcular la tasa de recuperación; consulte la Tabla 4. Grupo de control de diluyente: Tome 10 ml de cada una de las cinco soluciones bacterianas anteriores (bacterias de prueba 500 ~ 1000 ufc), opere de la misma manera que el grupo de control de prueba y calcule la tasa de recuperación; consulte la Tabla 5. Grupo de control de dilución: tomar 10 ml de cada una de las cinco soluciones bacterianas anteriores (500-1000 ufc de bacterias de prueba), operar de la misma manera que la sustancia de prueba y calcular la tasa de recuperación; consulte la Tabla 4. Calcule la tasa de recuperación (%) de acuerdo con la siguiente fórmula:
Los experimentos anteriores muestran que la tasa de recuperación de cada bacteria de verificación cumple con los requisitos del Apéndice de la Farmacopea, lo que indica que este método se puede utilizar para contar bacterias. , mohos y levaduras en este tipo de medicamentos es factible.
2.5.2 Grupo de prueba de verificación del método de inspección de bacterias de control: tomar 10 ml de la solución de prueba 1:10 anterior, agregarlos a 100 ml de la solución mezclada anterior, filtrar con una membrana de filtro, el método de lavado es el mismo que el anterior, y se agrega la membrana de filtro con el correspondiente cultivo de enriquecimiento bacteriano en 100 ml de medio de cultivo como grupo de prueba. Grupo de control en blanco: Tome 10 ml de la solución mezclada anterior y opere de la misma manera que el grupo de control en blanco de diluyente. Grupo de control negativo de bacterias: Tome 10 ml de solución de prueba 1:10, agregue 100 ml de la solución mezclada anterior, filtre con un filtro de membrana, enjuague con el mismo método que el anterior, pero agregue 10~100 ufc de control negativo apropiado al tercer enjuague con bacterias (por ejemplo, Staphylococcus aureus se usa como bacteria de control negativo para el examen de Escherichia coli), y luego se agrega la membrana a 100 ml del medio de cultivo correspondiente para el cultivo de enriquecimiento bacteriano como grupo de control bacteriano negativo. Grupo de control de bacterias negativas. Grupo de control de bacterias positivas: Tome 10 ml de la solución de prueba 1:10, agréguelos a 100 ml de la solución mezclada anterior, filtre con un filtro de membrana, el método de lavado es el mismo que el anterior, pero agregue 10 ~ 100 ufc de la solución apropiada. bacterias (como la prueba de Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), y luego agregue la membrana a 100 ml del medio de cultivo correspondiente como grupo de control bacteriano positivo.
Cultivar cada uno de los grupos anteriores a 35-37°C durante 18-24 horas, respectivamente, en los medios de cultivo correspondientes, y luego colocarlos a 35-37°C durante 18-24 horas. los resultados del grupo de control de bacterias positivas crecieron bien, lo que indica que los medicamentos tratados con este método no tuvieron efecto antibacteriano o que su efecto antibacteriano pudo ignorarse. No se detectaron bacterias negativas, lo que indica la exclusividad del método de examen bacteriológico de control e indica que; Las bacterias negativas no fueron detectadas por este método.
3. Discusión
Este estudio experimental muestra que los medicamentos azólicos tienen fuertes efectos inhibidores sobre bacterias y hongos al mismo tiempo. Para aquellos medicamentos con una fuerte actividad antibacteriana, primero debemos averiguarlo. Sólo eliminando su efecto inhibidor se puede alcanzar sin problemas el límite de detección de microorganismos.
Si se utiliza la filtración por membrana para pruebas de límite microbiano de medicamentos, el tipo y la cantidad de diluyente y solución de enjuague utilizados son muy importantes e incluso pueden determinar la aplicabilidad del método. Como diluyentes y soluciones de lavado para pruebas de límite microbiano, no solo deben tener la función de disolver medicamentos, sino también mantener la permeabilidad de las membranas celulares bacterianas, reparar las células dañadas y destruir el daño causado por los medicamentos a las células bacterianas. En la fórmula de la solución de enjuague determinada en este experimento, la histidina es una de las fuentes importantes de nitrógeno para el crecimiento de Candida albicans; la lecitina puede desempeñar un papel importante en la reparación de las membranas celulares, el polisorbato 80, como surfactante, puede reducir el crecimiento bacteriano en la superficie; La tensión entre la superficie de contacto circundante con el medio de cultivo permite que los nutrientes periféricos ingresen a las células más rápido, promoviendo así un crecimiento más rápido de bacterias y otras actividades. La lecitina y el polisorbato 80 se pueden usar juntos para neutralizar los agentes bacteriostáticos. Los productos neutralizados tienen poco impacto sobre las bacterias y los medios de cultivo. Por lo tanto, agregar estas sustancias a los diluyentes y enjuagues puede reducir eficazmente los efectos de los agentes sobre las bacterias y los medios de cultivo al mismo tiempo. promoviendo el crecimiento de bacterias y hongos dañados.
Existen ciertas diferencias de calidad entre algunos reactivos y reactivos nacionales y los productos importados. La fórmula de la solución de enjuague registrada en la Farmacopea Europea contiene un alto contenido de lecitina y polisorbato 80. Cuando se formula con productos nacionales, su contenido es elevado. La mala solubilidad da como resultado una solución turbia, un gran volumen de lavado y una velocidad de filtración de la solución lenta, lo que afecta el efecto de lavado e incluso imposibilita la filtración. Este problema se puede resolver eficazmente reduciendo la cantidad de cada componente en la fórmula. La práctica ha demostrado que incluso si la dosis de cada componente de la fórmula se reduce a la mitad, el efecto aún puede satisfacer las necesidades experimentales y la velocidad de filtración es adecuada, lo que también puede reducir el costo experimental.
[Referencias]
[1] Comisión Nacional de Farmacopea. Farmacopea China [S]. Beijing: Chemical Industry Press, 2005.
[2]. ] Farmacopea Europea [S]. Quinta edición. Apéndice XVI B.A377.
[3] Farmacopea Europea [S].