Ensayo de proteína N-terminal

La degradación de Idam es un método químico para secuenciar proteínas mediante la determinación de la secuencia de los residuos de aminoácidos N-terminales libres de la cadena polipeptídica. Primero modifique el residuo de aminoácido N-terminal con isotiocianato de fenilo, luego corte el residuo modificado de la cadena polipeptídica, identifíquelo mediante cromatografía y luego recupere el resto de la cadena polipeptídica (falta un residuo) y realice el siguiente ciclo de degradación. .

La secuenciación de la degradación de P. Edman consta de cuatro procesos principales: acoplamiento, hidrólisis, extracción y conversión. Las proteínas o péptidos se tratan primero con isotiocianato de fenilo (PITC) en condiciones alcalinas a pH 9,0. PITC reacciona con residuos de aminoácidos en el extremo N de la cadena peptídica para formar derivados de feniltiocarbamilo (PTC), concretamente péptidos de PTC. Luego, el péptido PTC se trata con ácido trifluoroacético para escindir selectivamente el enlace peptídico del residuo de aminoácido N-terminal, liberando el derivado de tiazolidinona-anilina de ese residuo de aminoácido. Luego, el derivado se extrae de la solución de reacción usando un disolvente orgánico como clorobutano, mientras que el péptido al que se le ha eliminado un residuo de aminoácido N-terminal permanece en solución. Los derivados de tiazolidinona-anilina extraídos son inestables y se ciclarán aún más bajo la acción del ácido para formar derivados estables de feniltioiltiourea (PTH), concretamente aminoácidos de PTH (que se muestran a continuación).

El péptido que queda en la solución se reduce en un residuo de aminoácido y luego se repite el proceso de reacción anterior y el secuenciador completa automáticamente todo el proceso de secuenciación. Cada ciclo produce un aminoácido PTH que puede identificarse mediante HPLC. La mayor ventaja del método de degradación de Edman es que la hidrólisis puede eliminar los residuos de aminoácidos marcados terminalmente sin destruir la cadena peptídica restante.

Cuando una proteína contiene uno o más residuos de cisteína, en ocasiones un par de residuos de cisteína se entrecruzan mediante un enlace disulfuro. En este caso, el método de secuenciación consiste en escindir primero los enlaces disulfuro mediante tratamiento (como el uso de ácido acético) y luego secuenciar mediante degradación de Edman.