Mgp farmacéutico
1. Materiales principales
Uroquinasa cruda (producida mediante el método del gel de sílice), glicina (CP), ácido sulfúrico (AR), hidróxido de sodio (AR) y ácido clorhídrico.
Hidrogenofosfato de sodio, Hidrogenofosfato de disodio, Azida sódica, Resina 714.
II. Proceso de prueba y condiciones técnicas
Análisis
1. Tomar 200 gramos de uroquinasa cruda (actividad específica: 325 iu/mgP) y agregar 8 veces. la cuantía de la Suspensión. Tampón de glicina SM en pulgadas, la concentración de uroquinasa es 4500 iu/ml, mantener baja temperatura, agitar durante 75 minutos, dejar reposar durante 45 minutos, sifón para separar el sobrenadante y el sedimento del fondo.
2. Agregue 1x tampón de glicina al precipitado después de extraer el sobrenadante. Trate como se indicó anteriormente y tome el sobrenadante.
3. Combinar los dos sobrenadantes y añadir lentamente SNH:50. Acondicionamiento del líber a bajas temperaturas. piedra. 1 (precio de muestra).
(2) Decoloración de la resina 714
1. Según el título de la solución de análisis, utilice 1,4 kg de resina por cada 100 millones de unidades y enjuague la resina con varios volúmenes de lecho. de agua destilada para su uso posterior.
2.PH10. El caudal se controla a 1,8 ~ 2,0 ml/cmZ y se recoge el efluente. Después de cargar la columna, lave la columna con un volumen de lecho de agua destilada criogénica.
3. Utilice sNHZSO "" para ajustar el valor de pH del efluente de la columna combinado a 10,0 y 0,1.
(3) Tratamiento de ultrafiltración
1. Establecer el valor de pH en 10. El líquido decolorado se desaliniza mediante ultrafiltración y se concentra hasta aproximadamente una sexta parte del volumen original.
2. Añadir agua destilada a baja temperatura a la solución concentrada y diluirla hasta una conductividad de 4,smV (10°C).
3. Concentrar nuevamente a una sexta parte del volumen.
4. Añadir baja temperatura al concentrado secundario. Se diluyen 0,18 m, tampón de fosfato de pH 6,8 y agua destilada hasta el volumen original. La relación entre los dos debe hacer que la conductividad de la solución diluida sea de 4,8 × 0,1 mv (a 10 °C).
5. Utilice SNHZSO para ajustar el valor de pH a 6,8 y 0,1.
6. Recalibrar la conductividad a 4,8 onzas. . Baja velocidad del viento (10 ℃).
(4) Purificación en gel de intercambio CM-S (baja temperatura)
Pretratar con 1. CM-s: Remojar el CM-s en agua destilada, tratarlo con NaOH y HCL respectivamente, luego tratarlo con 0,18 M, equilibrarlo con una solución tampón de fosfato de pH 6,8 y filtrar el CM-S en fosfato; tampón que contenía 0,08% NaN:, 0,18M, pH 6,8, y refrigerado a baja temperatura.
2.Adsorción de CM-s
(1) Ultrafiltrar la solución de ácido úrico con pH 6,8 y conductividad de 4,smV, agregar CM-S equilibrado en skg/100 millones de unidades, agitar .
Remueve durante dos horas para evitar que se forme espuma, déjalo reposar durante una hora y extrae el sobrenadante con un sifón.
(2) Coloque el CM-S adsorbido con uroquinasa en la columna de vidrio orgánico para evitar la formación de espuma en la columna y suavizar la columna.
3. Lave las impurezas
(1) CM-s, luego lave con tampón de fosfato que contenga NaN3 al 0,3 %, PH6,8 y 0,18 M a un caudal de 1,8 ~<. /p>
2. Pero /cmZ es aproximadamente, el título del efluente es inferior a 10oiu/min y el pico de absorción de luz es inferior a 28onm. 04e/ya.
(2) Uso 1. Lavar la mitad del volumen del lecho con tampón fosfato SMPH6.8. El caudal es constante y el pico de absorción de 280 nm del efluente debe reducirse por debajo de 0,03.
4. Elución de ácido úrico
(1) Después del lavado, utilice hidrogenofosfato disódico H8.8 de 0,08 MP y tampón de hidróxido de sodio 0,95 M para eluir a un caudal. 4,4 ml/cm2, mida la potencia del efluente y el pico de absorción a 280 nm y combine el efluente activo para que la concentración de la solución mezclada sea superior a 500 pulg./ml.
(2) Ajuste el valor de pH de la solución mezclada a 6. ~7.0 Después del muestreo y análisis, colóquelo en una botella de plástico de 2 litros, congélelo con hielo seco y guárdelo a baja temperatura por debajo de 22 °C.
(5) Determinación del título de ácido úrico y actividad específica [Reino Unido]
1 Principio de prueba
(1) Reactivos y equipos principales
Baño de agua a temperatura constante, despertador con escala, lámpara fluorescente, dibujo de títulos británico, trombina bovina (T), plasminógeno bovino (PG), fibrina bovina (FG), estándar británico, barbitón sódico, Tri. Nazetta
(2) Preparación del reactivo
t: Trombina bovina 40BP (Instituto de Medicamentos y Productos Biológicos, Ministerio de Salud), agregar 6,6 ml de tampón barbitúrico sódico a cada rama de líquido.
PG: Plasminógeno bovino 22BP (Instituto de Medicamentos y Productos Biológicos, Ministerio de Salud), añadir 24ml de tampón Tris a cada tubo.
PG-T: Coge PG6.6nil y el 6 configurado. Mezcla Anti-T, mezclar uniformemente, poner en un matraz triangular al 50%, atar la boca y reservar.
FG: Tabletas de Fibrinógeno, 12sBP (Instituto para el Control de Medicamentos y Productos Biológicos, Ministerio de Salud), agregar 18ml de Barbiton-Na a cada tableta.
Solución tampón.
(3) Dilución estándar británica
Utilice una solución de barbitúricos para diluir el estándar (100 iu/artículo) a 60 pulgadas/ml.
(4) Dibuje la curva estándar
①Tome 4 tubos de ensayo en la posición de las 5 en punto, márquelos respectivamente y agregue FGO.3
②Agregar respectivamente, soluciones estándar del Reino Unido en diluciones de 0,4, 0,3, 0,2 y 0,lm.
③Agregue 0,6, 0,7, 0,3 y 0,9 veces de solución de barbitúricos respectivamente.
(4) Agregue 0,4 ml de PG-t respectivamente, agite bien y coloque inmediatamente a 37 °C constante; temperatura En la olla soluble en agua, registre el tiempo
⑤ Observe las burbujas subiendo, y cuando el volumen se reduzca a la mitad, registre el tiempo de finalización
⑥ Saque la unidad; título como abscisa y tiempo como ordenada. La curva estándar requiere al menos tres puntos en la línea recta.
(5) Detección de muestras
(1) Después de dibujar la curva estándar, use los mismos reactivos y muestras para detectar en las mismas condiciones;
② Agregar FGO.3ml, tampón barbitúrico 0.gml y PG-to 4mh respectivamente.
③Los pasos restantes son los mismos que antes.
(6) Mida el valor del diámetro exterior
Después de agregar ácido, diluya la muestra 10 veces y luego mida su valor O D.
(7) Calcular título y actividad específica.
① Según el tiempo de subida de la burbuja de la muestra de prueba, encuentre el título del punto correspondiente en la curva estándar, multiplíquelo por 20 y obtenga la muestra.
Título real.
②Título total ~ título unitario (iu/mDx volumen total (ml)
③Actividad específica ~ título promedio xl.75/0 D
2. Determinación de rendimiento del producto y actividad específica
① Determine el título total y la actividad específica de la solución de análisis. Los resultados son los siguientes:
Título total: 24,89 millones de unidades, actividad específica: 325 iu/. mgP.
② Título total y actividad específica después de la purificación
Título total: 654,38+008.200 unidades; actividad específica: “660 iu/mgP”
③Rendimiento refinado. : 41%
3. Discusión
1. La uroquinasa generalmente existe en dos formas moleculares, es decir, el peso molecular es 36... y 54000, que tienen uroquinasa de alto peso molecular.
La actividad de la uroquinasa de bajo peso molecular es mucho más fuerte. Para aumentar la actividad específica, es necesario eliminar las impurezas y la uroquinasa de bajo peso molecular. El peso de la uroquinasa se puede recuperar y purificar.
2. Como sustancia activa, se debe evitar que la uroquinasa se inactive durante el proceso de purificación.
En el proceso de nuestra investigación, en primer lugar,
ser competente en los pasos para medir el título de uroquinasa y la actividad específica, y luego cambiar constantemente las condiciones operativas y mediante el análisis de cada proceso
para mejorar Se estudiaron los factores de rendimiento de uroquinasa y actividad específica, y se exploraron gradualmente las condiciones óptimas del proceso.
3. Ultrafiltrar las aguas madre después de la adsorción de CM-S y parte del eluato de CM-S con un título superior a 200 iu/ml.
Se pueden utilizar análisis y recuperación como materias primas.
El valor del pH de la orina masculina utilizado para extraer la uroquinasa es
/ml, y el pH se ajusta a 8,5-9 con hidróxido de sodio 3N. Después de agregar diatomita para adsorber y precipitar, filtrar la diatomita, agitar y lavar con agua limpia, centrifugar, colocar en una columna de intercambio, enjuagar con agua con amoníaco, agregar fosfato disódico saturado al eluyente, ajustar el pH a 8,0 y luego agregar cloro Ajustar la conductividad a 22Mn con cloruro de sodio, reticular la columna de cromatografía en gel de polisacárido con éster etílico cuaternario, luego eluir con tampón fosfato y combinar los efluentes. Ajustar la conductividad a 16~17Mn-', pasar por la columna de cromatografía de metilcelulosa y eluir con agua con amoníaco. Recoger el eluato, añadir agua para diálisis y liofilizar con una centrífuga para obtener el producto final de uroquinasa. La uroquinasa mencionada anteriormente es sólo un producto bruto y también puede modificarse y refinarse con dextrano, heparina, albúmina sérica humana, etc. Potenciar su estabilidad bioquímica y extender su tiempo de acción en el cuerpo humano. Además de los métodos de separación anteriores, la uroquinasa también se puede preparar mediante degradación de proteasa neutra. También existe un método de ADN recombinante en el extranjero para cultivar prouroquinasa en E. coli. Mientras se extrae la uroquinasa, la albúmina en orina humana también se puede extraer de la orina residual.
La uroquinasa es una proteasa alcalina sin efectos secundarios como antigenicidad o toxicidad. Puede usarse clínicamente para embolia pulmonar, enfermedad coronaria, trombosis cerebral, infarto de miocardio, opacidad vítrea, hemorragia del fondo de ojo, hematoma intracraneal. Tratamiento de enfermedades como la trombosis venosa y la glomerulonefritis aguda (crónica). También se puede utilizar para tratar enfermedades causadas por la deposición de fibrina y como fármaco auxiliar contra el cáncer. Además, la uroquinasa también se puede utilizar para desarrollar bebidas saludables, bebidas espaciales y cosméticos. Como empresa municipal, el desarrollo de productos de uroquinasa no solo requiere baja inversión, alta eficiencia y bajo consumo de energía, sino que también cuenta con materias primas fáciles de obtener, procesos simples, no tóxicos, inofensivos y libres de contaminación, y es digno de promoción.