¿Cuáles son las diferencias entre la extracción de ARN total de sangre y la extracción de tejido?

Recolección de muestras de tejido 1. Primero prepare el papel de aluminio o el tubo de criopreservación usado para empaquetar la muestra y use un marcador a base de aceite para escribir el número de la muestra en varios lugares de la superficie del papel de aluminio o del criopreservación. tubo. 2. Extirpe con precisión el tejido requerido. 3. Aislar el tejido fresco y eliminar inmediatamente el tejido conectivo, el tejido adiposo y otros tipos de tejido que no sean necesarios para la investigación. 4. Enjuague las muestras en solución salina al 0,9 % sin ARNasa para eliminar la sangre y la suciedad. 5. Utilice el papel de aluminio preparado o el tubo de criopreservación para cargar y envolver el tejido y colocarlo rápidamente en nitrógeno líquido para enfriarlo. 6. Coloque la bolsa de muestra (bolsa de gasa, etc.) en nitrógeno líquido para congelarla y luego coloque el tejido enfriado con nitrógeno líquido en la bolsa de muestra (cada bolsa de muestra solo almacena el mismo tejido. Cuando hay muchas muestras, deben dividirse en varias bolsas No coloque demasiadas muestras en una bolsa de muestra (en caso de que no se pueda colocar en el tanque de nitrógeno líquido o no se pueda sacar del tanque de nitrógeno líquido), deje una cuerda numerada en la boca de la bolsa. y pegue 2 pedazos de papel para etiquetas en la cuerda (nota en la etiqueta: nombre del cliente, nombre de la muestra, número de serie, fecha, pegue 2 pedazos de papel para etiquetas para evitar que las etiquetas se caigan y causen confusión en la muestra), transfiéralo rápidamente al tanque de nitrógeno líquido. 7. Complete el formulario de registro de muestra e indique el nombre de la muestra, tipo de tejido, número de serie, fecha de muestreo, proceso de procesamiento de la muestra, etc. Notas: 1. Al recolectar tejido tumoral, el tejido tumoral y el tejido normal deben determinarse con la mayor precisión posible. Si es posible, utilice los resultados del informe de la sección congelada para determinar el área a estudiar. 2. No utilice tubos Eppendorf para almacenar muestras de tejido, ya que los tubos Eppendorf pueden explotar fácilmente cuando se sacan del nitrógeno líquido, provocando la pérdida de la muestra. 3. Los pasos 2 a 5 deben realizarse lo más rápido posible en hielo. Un tiempo excesivo provocará la degradación del ARN de la muestra. 4. Si las muestras patológicas o normales recolectadas durante las operaciones clínicas no están disponibles para su extracción inmediata del quirófano para su posterior procesamiento, transfiéralas a nitrógeno líquido para su almacenamiento inmediatamente después de la resección. 2. Recolección de células y muestras de sangre Células adherentes 1. Una vez completado el cultivo o tratamiento de las células adherentes, retire el medio de cultivo 2. Agregue reactivo TRIzol a razón de 1 ml de reactivo TRIzol por 10 cm2 de área de cultivo 3. Use una pistola de 1 ml. Pipetee repetidamente con la cabeza para hacer que TRIzol entre en contacto con la superficie de todos los matraces de cultivo con las células para una digestión completa. 4. Transfiera a un tubo de ensayo libre de ARNasa y use una jeringa desechable para batir repetidamente las células hasta que no haya grumos; Las células son visibles. La solución completa debe ser transparente y no pegajosa. 5. Almacenar en hielo seco o en un refrigerador a -80°C. Células en suspensión 6. Después de cultivar o tratar las células en suspensión, retire el medio de cultivo; 7. Lave las células retenidas rápidamente con tampón PBS y centrifugue para eliminar el tampón PBS. 8. Agregue 1 ml de TRIzol por cada 5 x 106 células. reactivo y bombee las células repetidamente con una jeringa desechable hasta que no se vean grumos de células y toda la solución sea transparente pero no viscosa. 9. Guárdelo en hielo seco o en un refrigerador a -80°C; Sangre 1. Agregue un volumen igual de PBS (1x) a la sangre entera fresca a la que se le agregó anticoagulante y mezcle bien. 2. Transfiera lentamente a otro tubo de centrífuga al que se le haya agregado solución de separación de linfocitos y mezcle la mezcla anterior; Por encima del nivel del líquido de separación de linfocitos (es decir, no mezcle los dos líquidos, mantenga una interfaz clara), centrifugue a 3000 g durante 30 minutos. 3. Utilice una pipeta para separar cuidadosamente la capa de glóbulos blancos; PBS (1×), centrifugar para recuperar los leucocitos y desechar el sobrenadante; 4. Añadir 20 veces el volumen de reactivo TRIzol a los leucocitos y utilizar una jeringa desechable para bombear repetidamente las células hasta que no se vean grumos de células y los toda la solución es transparente pero no viscosa; 5. Guárdela en hielo seco o en un refrigerador a -80°C. 3. Flujo de operación de preparación de muestras de ARN total 1. Los reactivos y otros elementos utilizados para la extracción de ARN deben estar libres de ARNasa y los experimentos deben realizarse en un ambiente limpio y sin ventilación tanto como sea posible.

2. Debe utilizar un método de extracción con el que esté familiarizado o que se reconozca que produce buenos resultados experimentales (como EasyExtract, TRIzol o RNeasy) para la extracción de ARN. 3. Puede elegir el método de almacenamiento de ARN según las necesidades reales: las muestras de ARN que necesitan almacenamiento a largo plazo se almacenan en etanol al 75%; las muestras de ARN que no necesitan almacenamiento a largo plazo se almacenan en agua bidestilada sin RNasa o; Tampón de elución. La concentración de la muestra no debe ser baja, 3 μg/μl (la concentración de la muestra que requiere amplificación no debe ser inferior a 0,2 μg/μl). 4. La calidad del ARN, es decir, la proporción A260/A280 debe ser de alrededor de 2. La electroforesis de ARN total requiere bandas claras de ARNr 18s y 28s. Al mismo tiempo, la proporción 28s/18s debe ser superior a 2:1 y se debe incubar en un. baño de agua a 70°C durante 1 hora No hay diferencia significativa entre el patrón de electroforesis después y el patrón antes del aislamiento del baño de agua.