Mecanismo de trombólisis
La uroquinasa (uK) puede purificarse a partir de orina humana o secretarse mediante cultivos de células de riñón embrionario humano. Es una serina proteasa compuesta por dos cadenas polipeptídicas con pesos moleculares de 20 kDa y 30 kDa conectadas por enlaces disulfuro. UK tiene dos formas moleculares: s1 (31 kDa) y s2 (32 kDa). s1 es el producto de degradación de proteínas de s2.
UK actúa directamente sobre el enlace peptídico de arg561-Val562 en la pág. Una vez roto el enlace peptídico, se genera una molécula activa de doble cadena pm unida por un enlace disulfuro, que hidroliza el fn insoluble que constituye el trombo y ejerce un efecto trombolítico. El Reino Unido no tiene antigenicidad, lo cual es su ventaja.
La estreptoquinasa (sK) es una proteasa secretada por los estreptococos betahemolíticos. Es una proteína monocatenaria con un peso molecular de 47kDa, con isoleucina (ile) en el extremo amino y lisina (lys) en el extremo carboxilo. SK se combina con pg en una proporción molar igual en la sangre para formar un complejo sK pg. El sitio activo de pg en el complejo queda expuesto mediante desplazamiento molecular, lo que activa pg para que se convierta en pm y, finalmente, se produce una reacción fibrinolítica para degradar el trombo.
El gen sK se aisló de Streptococcus equi y se expresó en Escherichia coli para obtener SK con actividad trombolítica. Actualmente, los preparados de SK se pueden preparar a gran escala mediante tecnología de ingeniería genética.
Tanto el uK como el SK que ingresan a la circulación sanguínea pueden activar inmediatamente el sistema fibrinolítico, por lo que antes de que el fármaco llegue al sitio del trombo, pg se activará en pm, aumentando así el nivel de fibrinógeno (fg) en la sangre. . cayó significativamente. Al mismo tiempo, debido a los efectos de pA 1,2 (pA 2 (inhibidor de pA 1, 2) y antiplasmina α2 (α2aP), la vida media del fármaco se une rápidamente a pA y neutraliza su actividad, lo que la hace muy corta. vivió en el plasma y se eliminó rápidamente. Por lo tanto, la dosis de tratamiento clínico también es muy grande.
Complejo de activación de anisol plasminógeno-estreptoquinasa
APSAC es una combinación de pg y sK con sustancias químicas benzoílicas. (como aPAN) se combina con una valencia molecular 1:1 para formar un complejo de acoplamiento pg-sK. El centro activo en pg en el complejo (la posición ser740 de la cadena ligera) se acila de forma reversible, lo que ralentiza el proceso. formación de pm y evitando la neutralización de α2aP, previene la activación excesiva de pg en la periferia del trombo y reduce la tendencia al sangrado
Debido a que el sitio de unión a lisina (lBS) de pg tiene afinidad específica por fn en el. El complejo todavía está expuesto, el complejo sK-Pg se puede enriquecer en el sitio del trombo unido a fn y se desacetila a una cierta velocidad, formando así pm, disolviendo fn y eliminando el trombo. Al mismo tiempo, el acoplamiento de sK a pg enmascara el efecto del sitio antigénico sK, reduciendo así su inmunogenicidad. Además, la desacilación del sitio del trombo mejora la especificidad fn del complejo y previene la autodigestión del complejo como se demuestra en modelos de trombos animales. aPSAC tiene un efecto trombolítico más significativo que el complejo pg sK no acilado
pA tisular (t-PA) y sus mutantes
T-PA es una glicoproteína A monocatenaria. un peso molecular de 70 kDa, derivado del cuerpo humano. Bajo la acción de PM o tripsina, el enlace peptídico arg275-Ile276 del t-PA se rompe para formar una doble cadena de t-PA conectada por un enlace disulfuro. cadena ligera (32 kDa), que pertenece al dominio similar a la serina proteasa (P) y es el centro catalíticamente activo. El extremo amino es una cadena importante (36 kDa) y consta de cuatro dominios: F, eGF, k1 y k2. >
El t-PA de cadena simple y doble tiene las mismas propiedades de activar pg. Cuando se produce la trombosis, el t-PA puede activar rápidamente pg para disolver el trombo a través de k2 y F. Conectando fn, el fn/trombo conectado a. El t-PA aumenta la afinidad por pg, formando un complejo ternario cíclico de T-PA PG FN [3], y el pm activado reduce rápidamente el ángulo del trombo fn.
Además, los estudios han demostrado que el t-PA. Se neutraliza y degrada después de formar un complejo con pAI-1 en la sangre, y se metaboliza en el hígado. Por lo tanto, se elimina rápidamente en el cuerpo, con una vida media de solo 4 a 8 minutos, los investigadores utilizan la ingeniería genética. tecnología para cambiar el t-PA para mejorar la farmacocinética o las propiedades funcionales
Actualmente se han obtenido en el extranjero muchos mutantes de t-PA recombinante (rt-PA).
Sin F, E y k1, sólo quedan los dominios k2 y P, es decir, sólo se conservan el sitio de unión específico y el centro activo catalítico. El bM06.022 obtenido es un mutante no glicosilado y su vida media in vivo se prolonga de 4 a 5 veces. La sustitución o eliminación de uno o más aminoácidos en los dominios F y E también funciona bien. Por ejemplo, si se usa ser para reemplazar el dominio E de cys84, su vida media se puede extender de 6 minutos a 20 minutos. Para otro ejemplo, cuando asn y glu(ala)4 reemplazan a thr103, asn117 y lys296-His-Ary-Arg respectivamente, el tiempo de eliminación de rt-PA-TNK en la sangre se extiende 8 veces y la especificidad para fn es mejorado. La capacidad anti-pAI-1 se mejora 200 veces.
Uroquinasa pA monocatenaria (scu-PA) y quimeras
Scu-PA, también conocida como pro-uK, es el zimógeno precursor de la uK de doble cadena y es una A glicoproteína con baja actividad uK. Bajo la activación de pm, el enlace peptídico lys158-Ile159 se rompe fácilmente, produciendo una forma activa de doble cadena.
Cuando no hay fn en plasma, scu-PA es relativamente estable y no activará PG debido a la inhibición competitiva por α2aP. Pero una vez que se forma un trombo, scu-PA tiene una mayor afinidad por la pg unida a la fn que por la pg libre, lo que induce una trombólisis específica. Además, el fragmento degradado (e-2) de fn puede promover selectivamente la activación de pg por scu-PA mejorando el acoplamiento entre pg y fn parcialmente degradado.
El Scu-PA se obtuvo por primera vez a partir de la orina y ahora el scu-PA humano se obtiene mediante tecnología de ADN recombinante. Es un derivado de bajo peso molecular que carece de 143 residuos en el extremo amino (rscu-PA32K). En comparación con el Reino Unido, tiene el mismo efecto fibrinolítico sin destruir fg. El modelo de trombosis de la vena yugular del conejo confirmó la relación dosis-efecto entre scu-PA y la fibrinólisis sistémica.
Algunas personas han construido pA quimérico recombinante, que utiliza diferentes regiones de la cadena pesada de rt-PA y el dominio activo de proteasa de scu-PA para formar varias quimeras. Los modelos de trombosis en animales muestran que el metabolismo de k1 y K2pu (k1 k2 de RT-PA se une a la región pu de scu-PA) se ralentiza en el plasma y la vida media del antígeno relacionado se extiende de 9 minutos a 70 minutos. minutos, pero se mantiene su fibrinólisis. Los niveles de α2aP y fg en sangre se mantuvieron sin cambios.
Glucoquinasa
La glucoquinasa (saK) es una proteína secretada por Staphylococcus aureus y tiene actividad fibrinolítica. Sin embargo, la saK natural es muy tóxica y provoca hemorragias graves.
SaK es un polipéptido monocatenario compuesto por 136 aminoácidos. Consta de dos dominios plegados del mismo tamaño, con un peso molecular de 15kDa y un coeficiente de sedimentación de 1,71S. Se ha descubierto que la saK madura y la saK-Δ10 mutante tienen la misma actividad fibrinolítica hasta que se eliminan 10 aminoácidos. Además, la metionina (met) en la posición 26 es el centro activo de saK. Recientemente, se descubrió que el fragmento de aminoácido amino terminal es extremadamente importante para la activación de pg.
La SaK en sí no actúa como una enzima, sino que se une reversiblemente a pg en una proporción equimolecular de 1:1. Luego, otras pg libres se activan en forma de complejo saK pg. A diferencia del complejo sK pg, el sitio activo de la serina proteasa en PG en el complejo Sak pg está expuesto, convirtiéndose en Sak PG → Sak PM, que es el paso limitante de la velocidad de todo el proceso de fibrinólisis. El propio SaK pm actúa como catalizador y puede acelerar la reacción. El α2aP en la sangre puede combinarse rápidamente con el pm en el complejo, inhibiendo así la fibrinólisis además de la trombosis. Cuando se produce un trombo, el IBS en pg(pm) en el complejo saK pg(pm) puede unirse rápidamente a la fn que constituye el trombo, impidiendo la unión de α2aP al complejo. Una gran cantidad de pg libre alrededor del trombo se activa en pm, lo que finalmente disuelve el trombo. Los experimentos in vitro muestran que si se disuelve el 50% del trombo, el nivel de pg en la sangre solo disminuirá un 5%. Por lo tanto, saK tiene una fuerte especificidad por fn y no afecta los niveles de fg durante la estimulación de la fibrinólisis.
Además, al ser una proteína de molécula pequeña, tiene una gran capacidad para penetrar los trombos. Tiene buena estabilidad sanguínea y un tiempo de acción prolongado. En la actualidad, el gen saK ha sido clonado a partir de los fagos saKφc y saK42D y expresado en E. coli mediante tecnología recombinante, consiguiéndose una producción a gran escala.
SaK tiene una antigenicidad evidente.
Recientemente, se usó ala para reemplazar de 2 a 3 aminoácidos cargados en el epítopo saK para obtener un mutante saK (saKSTAR m38) para reducir su inmunogenicidad.