Ingeniería genética de la melitina
El desarrollo de la tecnología de bioingeniería ha proporcionado una nueva forma de obtener melitina. Kindas et al. extrajeron el ARNm total de las glándulas venenosas de las abejas reinas vírgenes y descubrieron que el ARNm de la melitina contiene alrededor de 400 pares de bases y 1 corto. cola poli A. Vlasak et al. utilizaron el método de transcripción inversa de ARNm-ADN y utilizaron el plásmido pBR322 para construir una biblioteca de ADNc de la glándula del veneno de la reina. Utilizaron el ARNm total de la glándula del veneno de la reina para fabricar una sonda y aislaron el ADNc de la melitina de esta biblioteca. , y luego lo clonó en el plásmido pUC18. El análisis de la secuencia de ADN se realizó en los resultados del análisis de la secuencia de ADN. La secuencia de melitina inferida de los resultados del análisis de la secuencia de ADN fue exactamente la misma que la medida real. Zhang Qingwen comenzó a extraer ARN de la glándula del veneno de la abeja reina en 1991 y lo utilizó para la traducción en huevos del gusano del algodón. Sintetizó con éxito la promelitina y estudió los componentes del ARNm extraídos. Se descubrió que el ARN total se puede obtener con alta pureza después de eliminarlo. ARNr. de ARNm de melitina. Li Jizhou et al. sintetizaron el gen de la melitina mediante el método de transcripción inversa de ARNm-ADNc en 1997, establecieron una biblioteca de ADNc de melitina utilizando lgtll y seleccionaron clones adjuntos utilizando sondas de anticuerpos. Chen Zhongbing et al. clonaron aún más el ADNc de melitina en el plásmido Pucl8 de Escherichia coli y realizaron un análisis de secuencia. Wang Guanlin et al. extrajeron el ARN total de las glándulas de veneno de abeja y amplificaron el ADNc de la proteína precursora de melitina mediante RT-PCR. Además, introdujeron un sitio de escisión de amina antes de la secuencia de melitina mediante mutagénesis dirigida y construyeron el vector de expresión de la proteína mutágena de melitina. fusionado con la secuencia parcial de β-galactosidasa. Los resultados del análisis de secuencia mostraron que el codón diana se introdujo con éxito y formó un marco de lectura correcto con la secuencia parcial de β-galactosidasa, y expresó la proteína mutagenizada en E. coli. Wang Guanlin clonó el ADNc de la proteína precursora de melitina y expresó la proteína precursora de melitina fusionada con la secuencia parcial de β-galactosidasa en E. coli. Wang Qiubo et al. informaron que al sintetizar artificialmente dos fragmentos de oligonucleótidos AB que contienen sitios de corte de enzimas específicos, el gen objetivo se formó bajo la acción de la enzima Klenow y se usaron endonucleasas de restricción Hind Ⅲ y Xmn Ⅰ para cortar simultáneamente el gen objetivo y The. Se utilizó el plásmido Pmalp2 del vector de expresión para construir un recombinante de los dos bajo la acción de la ligasa T4. Los clones adherentes se seleccionaron mediante complementación α y se identificaron mediante digestión enzimática específica y análisis de secuenciación para obtener el clon de expresión procariota de la melitina recombinante.
El efecto hemolítico de la melitina limita su aplicación clínica. Para superar sus efectos secundarios hemolíticos, se ha intentado reducir sus reacciones adversas y mejorar la actividad antitumoral cambiando la conformación de las moléculas de melitina, acoplando moléculas de melitina con anticuerpos específicos de tumores para formar inmunotoxinas o elaborando agentes de liberación sostenida. Objetivo.
Para obtener melitina que conserve la actividad antibacteriana y reduzca la hemólisis, Zhao Yahua y otros modificaron la estructura molecular de la melitina. Cambie Val en la posición 5 a Arg, Ala en la posición 15 a Arg y elimine Leu en la posición 16. El gen de melitina modificado se obtuvo utilizando tecnología de PCR y se clonó en el vector de expresión de levadura humana pPICZa-A para obtener el plásmido de expresión recombinante PPICZa-A-MEA. El plásmido se transformó en Pichia pastoris GS115 y se expresó bajo inducción con metanol. Se midió la actividad antibacteriana y hemolítica del sobrenadante de fermentación y se purificó mediante cromatografía de afinidad. Los resultados mostraron que el gen de melitina se expresó con éxito en Pichia pastoris después de la transformación. La melitina expresada retuvo la actividad antibacteriana y redujo significativamente la actividad hemolítica. Después de la purificación, se determinó que el contenido de melitina expresada era aproximadamente 0,29 mg/ml utilizando el método de Bradford.
Li Bai, Zhang Chen y otros aplicaron la ingeniería genética para construir un vector de adenovirus recombinante que porta el gen de la melitina y el promotor de la alfafetoproteína (AFP) (rAFP), y exploraron los efectos del gen de la melitina impulsado por la rAFP en Vitro Efecto letal específico sobre las células cancerosas del hígado.
Los resultados mostraron que el vector adenoviral recombinante que porta el gen de la melitina se construyó con éxito. El experimento MTr demostró que después de la transfección del adenovirus recombinante que porta el gen de la melitina, la proliferación de células de cáncer de hígado asociadas a la AFP se inhibió significativamente, aunque no tuvo ningún efecto. En las células de cáncer de hígado negativas para AFP y en las células hepáticas normales, la transfección de adenovirus recombinante sin gen de melitina no tuvo ningún efecto inhibidor sobre la proliferación de diversas células. También encontraron que después de la transfección de células BEL-7402 con adenovirus recombinante con gen de melitina. , el ciclo de las células cancerosas del hígado se vio afectado en diversos grados, las células en fase Go/G aumentaron y el índice de etiquetado del antígeno nuclear de células proliferativas (PCNA) disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control, lo que indica que se bloquearon más células cancerosas en el grupo. La fase G y la expresión de genes de melitina en células cancerosas interfirieron con su ciclo celular, inhibiendo la proliferación de células cancerosas e inhibiendo la síntesis de PCNA puede ser uno de sus mecanismos. El desequilibrio entre la proliferación celular y la apoptosis determina la tasa de crecimiento de los tumores. La apoptosis no sólo afecta directamente al desarrollo normal, la diferenciación y la muerte de los tejidos corporales, sino que también ha recibido gran atención su papel en el tratamiento de tumores. Los estudios han demostrado que la melitina puede inducir la apoptosis de las células tumorales. Después de la transfección con adenovirus recombinante que porta el gen de la melitina, se observó bajo un microscopio de contraste de fase invertida que algunas células de cáncer de hígado mostraban cambios morfológicos apoptóticos, como tamaño más pequeño, redondez y bordes de cromatina. El adenovirus recombinante que porta el gen de la melitina puede inducir eficazmente la apoptosis de las células cancerosas del hígado, y la tasa de apoptosis es de aproximadamente el 20%, que es más alta que la del adenovirus recombinante que porta el gen de la melitina y el grupo de control de adenovirus recombinantes no transfectados, lo que sugiere que también es posible inducir La apoptosis de las células tumorales es uno de los mecanismos por los que funciona la terapia génica con melitina.