¿Cuál es la importancia de la cromatografía?

Porque la tecnología moderna de análisis cromatográfico tiene dos funciones: separación y análisis, es decir, puede eliminar la interferencia mutua entre componentes complejos y realizar análisis cualitativos y cuantitativos de los componentes uno por uno. Es muy adecuado para el análisis de componentes y la evaluación de la eficacia de fármacos crudos complejos.

Según su principio de separación, la cromatografía se puede dividir en: cromatografía de adsorción, cromatografía de distribución, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, etc. La cromatografía de adsorción aprovecha la diferencia en la capacidad de adsorción de las sustancias separadas en el adsorbente y utiliza elución con solvente o gas para separar los componentes. Los adsorbentes comúnmente utilizados incluyen alúmina, gel de sílice, poliamida y otras sustancias con actividad de adsorción. La cromatografía de distribución utiliza la diferencia en el coeficiente de distribución de la sustancia separada en dos fases para separar los componentes; una fase está recubierta o unida sobre un soporte sólido, llamada fase estacionaria, y la otra fase es un líquido o gas, llamada móvil. los portadores de fase fase comúnmente utilizados incluyen gel de sílice, tierra de diatomeas, adsorbente de silicio-magnesio y polvo de celulosa, etc. La cromatografía de intercambio iónico utiliza las diferentes capacidades de intercambio de las sustancias separadas en las resinas de intercambio iónico para separar los componentes; las resinas comúnmente utilizadas incluyen resinas de intercambio catiónico y resinas de intercambio aniónico de diferentes concentraciones, y la fase móvil es agua o un tampón que contiene solventes orgánicos. La cromatografía de exclusión por tamaño, también conocida como cromatografía en gel, utiliza los diferentes tamaños moleculares de las sustancias que se van a separar para provocar diferentes niveles de penetración en el relleno para separar los componentes. Los rellenos comúnmente utilizados incluyen tamices moleculares, gel de dextrano, polímeros microporosos y gel de sílice microporoso; o perlas de vidrio, etc., elija agua o disolvente orgánico como fase móvil de acuerdo con las propiedades de la fase estacionaria y la muestra de prueba.

Los métodos de cromatografía utilizados habitualmente se pueden dividir en cromatografía de capa fina, cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta resolución según el método de separación. Cuando se utiliza la cromatografía en capa fina para separar sustancias coloreadas, se pueden distinguir según sus bandas de color; cuando se separan sustancias incoloras, se pueden inspeccionar bajo luz ultravioleta de onda corta (254 nm) o de onda larga (365 nm), o rociar con luz ultravioleta. reactivo cromogénico para desarrollar el color, o usando una fina capa de gel de sílice añadido con sustancias fluorescentes en cromatografía de capa fina, y usando el método de extinción de fluorescencia para detectar. La cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta resolución pueden detectarse mediante varios detectores conectados a la salida de la columna cromatográfica.

En los últimos años, con la mejora de la automatización de diversos instrumentos cromatográficos, especialmente el desarrollo de diversas tecnologías con guiones, se ha vuelto cada vez más rápido utilizar la tecnología moderna de análisis cromatográfico para evaluar la eficacia y el control de calidad de los fármacos crudos. , sencillo y sensible.

(1) Cromatografía en capa fina (TLC)

En la cromatografía en capa fina, la solución de prueba se puntea sobre una placa de capa fina y se utiliza en un recipiente de revelado. Se revela el agente revelador. para separar los componentes contenidos en la muestra de prueba. El cromatograma obtenido se compara con el cromatograma obtenido por la sustancia de control apropiada en el mismo método, y puede escanearse con un escáner de capa delgada para identificación, inspección o determinación del contenido. En la Farmacopea China (edición de 2005), la cromatografía en capa fina se utiliza para la identificación cualitativa en 1523 artículos y la determinación del contenido en 45 artículos, entre los cuales cuatro materiales medicinales se determinan cuantitativamente mediante escaneo en capa fina.

1. Método de operación

(1) Tableros de capa delgada Hay tableros de capa delgada disponibles comercialmente (tableros comunes o de alta eficiencia) y tableros de capa delgada hechos en casa, que pueden ser seleccionados según las necesidades.

(2) La manchado generalmente se lleva a cabo en un ambiente limpio y seco, utilizando un tubo capilar especial o el correspondiente equipo de manchado semiautomático o automático para manchar la muestra en la placa de capa delgada, generalmente en la forma de puntos o estrecho Tiene forma de tira, y la línea base para manchar está de 10 a 15 mm desde el borde inferior. La línea de base general para tableros de alta eficiencia es de 8 a 10 mm desde el borde inferior. El diámetro de los puntos generalmente no supera los 3 mm y el de las placas de alta eficiencia generalmente no supera los 2 mm; tenga cuidado de no dañar la superficie de la placa de capa delgada al tocar el punto; El ancho de la tira es generalmente de 5 a 10 mm. El ancho de las lamas de alta eficiencia es generalmente de 4 a 8 mm y se pueden detectar rociando con un equipo de detección especial semiautomático o automático. La distancia entre puntos se puede utilizar para determinar la dispersión de los puntos visibles de modo que los puntos adyacentes no interfieran entre sí. Generalmente, no es inferior a 8 mm. La distancia entre muestras de prueba de placas de alta eficiencia no es inferior a 5 mm.

(3) Expansión: coloque la placa de capa delgada con la muestra de prueba en el tanque de expansión, sumérjala en el agente de desarrollo a una profundidad de 5 mm desde el origen y manténgala hermética. A menos que se especifique lo contrario, la expansión general hacia arriba es de 8 a 15 cm, y la expansión hacia arriba de los tableros de capa fina de alta eficiencia es de 5 a 8 cm. Cuando el frente de disolvente alcance el intervalo especificado, retire la placa de capa fina, séquela y espere a que se realice la prueba.

Si se requiere un equilibrio previo del vapor del solvente antes del revelado, se puede agregar una cantidad adecuada de agente revelador al cilindro de revelado, sellarlo y generalmente mantenerlo durante 15 a 30 minutos. Una vez preequilibrado el vapor del disolvente, la placa de capa fina que contiene la muestra de prueba debe colocarse rápidamente, sellarse y desplegarse inmediatamente. Si el cilindro de desarrollo se va a saturar con vapor de disolvente, se debe colocar un papel de filtro del mismo tamaño que el diámetro interior del cilindro de desarrollo dentro del cilindro de desarrollo y sellar durante un cierto período de tiempo para permitir que alcance la saturación y luego proceder como de costumbre. Si es necesario, se puede realizar una expansión secundaria o una expansión bidireccional.

(4) Desarrollo e inspección del color La muestra de prueba contiene componentes que se colorean bajo luz visible y se pueden inspeccionar directamente bajo la luz solar. También se pueden utilizar métodos de pulverización o inmersión para desarrollar el color con un revelador de color adecuado o. desarrollo del color del calor, vista a la luz del día. Las sustancias fluorescentes o las sustancias que pueden provocar fluorescencia cuando se exponen a ciertos reactivos pueden observarse en el cromatograma de fluorescencia bajo una lámpara ultravioleta de 365 nm. Para los componentes que son incoloros bajo luz visible pero que se absorben bajo luz ultravioleta, puede usar una placa de gel de sílice con agente fluorescente (como la placa de gel de sílice GF 254) y observar el cromatograma formado por el material de extinción de la fluorescencia en la placa fluorescente bajo un Lámpara ultravioleta de 254 nm.

(5) La grabación de imágenes TLC generalmente se puede tomar con un equipo de cámara y guardar en forma de fotografías ópticas o imágenes electrónicas. También se puede utilizar un escáner de capa fina para escanear y registrar el cromatograma correspondiente.

2. Prueba de idoneidad del sistema

Utilice la muestra de prueba y la sustancia de referencia para probar y ajustar las condiciones experimentales para garantizar que la sensibilidad de detección, la separación y la repetibilidad cumplan con los requisitos.

(1) Cuando la sensibilidad de detección se utiliza para una inspección limitada, la solución de prueba, la solución de referencia y la solución de referencia diluidas varias veces se utilizan para detectar muestras en la misma placa de capa delgada bajo las condiciones cromatográficas especificadas. , ampliar e inspeccionar, este último debe mostrar puntos claros.

(2) Separación Cuando se utiliza para la identificación, los puntos principales correspondientes en la solución de referencia y la solución de prueba deben mostrar dos puntos claramente separados. Cuando se utiliza para inspección de límites y determinación de contenido, se requiere una buena separación entre el pico cuantitativo y el pico adyacente. La fórmula de cálculo de la resolución (R) es:

R = 2(d 2 -d 1 ) /. (W 1 +W 2 ) Fórmula (3-5)

En la fórmula, d 2 es la distancia entre el último pico de los dos picos adyacentes y el origen d 1 es el pico anterior del; dos picos adyacentes. La distancia desde el origen; W 1 y W 2 son los anchos de pico de dos picos adyacentes. Normalmente la separación debería ser mayor que 1,0.

(3) Repetibilidad La desviación estándar relativa del área del pico medido del componente a medir cuando la misma solución de prueba se coloca en paralelo en la misma placa de capa delgada no debe ser superior al 3,0 %. ; debe medirse después del desarrollo del color. La desviación estándar relativa no debe ser superior al 5,0%.

3. Método de determinación

(1) Identifique y tome la solución de referencia y la solución de prueba de concentración adecuada, localícelas, desdóblelas e inspecciónelas en la misma placa de capa delgada para probar el color. (o fluorescencia) y la ubicación de los puntos principales mostrados por la solución de muestra deben ser consistentes con los de la solución de control.

(2) Verificación de límites: utilice una sustancia de referencia preparada cuantitativamente para comparar o una dilución de la sustancia de referencia para comparar. Los puntos a verificar en la cromatografía de la solución de prueba no deben tener un color (o fluorescencia) más oscuro que los puntos correspondientes en la solución de referencia correspondiente o la serie de soluciones de referencia o deben operarse de acuerdo con el método de escaneo de cromatografía en capa fina; y el valor del área del pico no debe ser mayor que el valor del área del pico.

(3) Determinación del contenido: determine el contenido de los componentes correspondientes en la muestra de prueba de acuerdo con el método de escaneo por cromatografía de capa fina.

4. El método de escaneo por cromatografía en capa fina

se refiere a irradiar luz de una determinada longitud de onda en una placa de capa fina para detectar puntos en la cromatografía en capa fina que pueden absorber luz ultravioleta o luz visible. , o Se escanean puntos que pueden emitir fluorescencia después de ser excitados, y los patrones escaneados y los datos integrados se utilizan para identificación, inspección o determinación de contenido. La medición se puede realizar según las características estructurales de diferentes escáneres de capa fina y según el método prescrito. Generalmente se selecciona el método de reflexión y se utiliza el método de absorción o el método de fluorescencia. Normalmente, para la determinación del contenido se deben utilizar placas de capa fina disponibles comercialmente.

El método de escaneo puede ser escaneo de longitud de onda única o escaneo de longitud de onda dual. Si se utiliza el escaneo de longitud de onda dual, se debe seleccionar como longitud de onda de referencia la longitud de onda en la que el punto a medir no tiene absorción o tiene una absorción mínima. El valor de cambio de relación (valor R f) del punto a medir en el cromatograma de. el producto de prueba y el espectro de absorción obtenido mediante escaneo o medición espectral deben usarse como longitud de onda de referencia. La absorción máxima y la absorción mínima del espectro obtenido deben ser consistentes con la sustancia de referencia para garantizar la precisión de los resultados de la medición.

La medición cuantitativa de escaneo de capa fina debe garantizar que la cantidad de manchas de la muestra de prueba esté dentro del rango lineal. Si es necesario, la cantidad de manchas de la solución de prueba se puede ajustar adecuadamente. La muestra de prueba y la sustancia de referencia se manchan, se extienden y se dispersan. medido y calculado en la misma placa.

(2) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

La cromatografía líquida de alta resolución utiliza una bomba de infusión de alta presión para bombear la fase móvil especificada a un Un método cromatográfico lleno para la separación y determinación mediante columna cromatográfica. La muestra de prueba inyectada es llevada a la columna por la fase móvil. Cada componente se separa en la columna y ingresa al detector. La señal cromatográfica es registrada por un registrador, integrador o sistema de procesamiento de datos.

La cromatografía líquida de alto rendimiento tiene las ventajas de una alta eficiencia de separación, una rápida velocidad de análisis, una buena reproducibilidad, precisión y sensibilidad. Su amplia gama de aplicaciones no tiene comparación con otros instrumentos analíticos. Con la popularización de los instrumentos y la comercialización de detectores de dispersión de luz por evaporación y detectores de espectrometría de masas, este método se ha convertido en la primera opción y el método principal para la determinación del contenido de fármaco crudo. La "Farmacopea China" (edición de 2005) utiliza cromatografía líquida de alto rendimiento para determinar el contenido de 479 tipos de medicinas tradicionales chinas, que abarcan 518 artículos, incluidos 98 tipos de materiales medicinales.

1. Requisitos generales para los instrumentos

(1) Columna cromatográfica El relleno de columna cromatográfica más utilizado es el gel de sílice unido químicamente. Los sistemas de cromatografía de fase inversa utilizan cargas no polares, siendo la sílice unida a octadecilsilano la más comúnmente utilizada; también se utilizan sílice unida a octilsilano y otros tipos de sílice unida a silano (como fases unidas a cianosilano e iguales unidas a aminosilano). Los sistemas de cromatografía de fase normal utilizan rellenos polares, los rellenos comúnmente utilizados incluyen gel de sílice, etc. Las cargas de intercambio iónico se utilizan para la cromatografía de intercambio iónico; las cargas con enlaces quirales se utilizan para el análisis de separación de enantiómeros.

El rendimiento del relleno (como la forma del soporte, el tamaño de las partículas, el tamaño de los poros, el área de superficie específica, la cobertura de la superficie del grupo de enlace, el contenido de carbono y el tipo de enlace, etc.) y el relleno. de la columna cromatográfica, afecta directamente el comportamiento de retención y el efecto de separación del analito. Los rellenos con diámetros de poro inferiores a 15 nm (1 nm = 10 nm) son adecuados para analizar compuestos con pesos moleculares inferiores a 2000. Para compuestos con pesos moleculares superiores a 2000, se deben seleccionar rellenos con poros superiores a 30 nm.

Los rellenos de fase estacionaria unidos en general que utilizan gel de sílice como vehículo son adecuados para fases móviles con un pH de 2 a 8. Cuando el pH es superior a 8, el gel de sílice portador se disolverá; cuando el pH es inferior a 2, la fase de enlace químico conectada al gel de sílice se hidroliza fácilmente y se desprende. Cuando se requiere una fase móvil con un pH superior a 8 en el sistema de cromatografía, se deben utilizar cargas resistentes a los álcalis, como gel de sílice adherido con gel de sílice de alta pureza como vehículo y alta cobertura superficial, cargas poliméricas recubiertas, compuestos orgánicos-inorgánicos. rellenos Rellenos híbridos o rellenos que no sean de gel de sílice, etc.; cuando se utiliza una fase móvil con un pH inferior a 2, se deben utilizar rellenos resistentes a los ácidos, como diisopropilo o grupos diisopropilo con grandes cadenas laterales que pueden producir protección estérica. -gel de sílice unido con octadecilsilano sustituido, cargas híbridas orgánico-inorgánicas, etc. Estas columnas especiales están disponibles comercialmente.

(2) Detector El detector más utilizado es el detector ultravioleta (UVD). Otros detectores comunes incluyen el detector de matriz de diodos (DAD) y el detector de fluorescencia (detector de fluorescencia (FLD), detector de índice de refracción (RID), detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD), detector electroquímico (ECD) y detector detector espectrométrico de masas, MSD), etc.

Los detectores ultravioleta, de matriz de diodos, de fluorescencia y electroquímicos son detectores selectivos, y sus valores de respuesta no sólo están relacionados con la concentración de la solución a medir, sino también con la estructura del compuesto.

Los detectores de índice de refracción diferencial y los detectores de dispersión de luz por evaporación son detectores universales que responden a todos los compuestos; el valor de respuesta del detector de dispersión de luz por evaporación a compuestos con estructuras similares está relacionado casi exclusivamente con la masa del analito. El detector de matriz de diodos puede registrar simultáneamente el espectro de absorción del objeto a probar dentro de un rango de longitud de onda específico, por lo que puede usarse para la medición espectral del objeto a probar y para la inspección de pureza de los picos cromatográficos.

El valor de respuesta de los detectores de ultravioleta, fluorescencia, electroquímicos y de índice de refracción diferencial tiene una relación lineal con la concentración de la solución a medir dentro de un cierto rango, pero el valor de respuesta del detector de dispersión de luz evaporativa es generalmente relacionado con la concentración de la solución a medir. No existe una relación lineal. Si es necesario, el valor de respuesta debe convertirse matemáticamente antes del cálculo.

Diferentes detectores tienen diferentes requisitos para las fases móviles. Si se utiliza un detector UV, la fase móvil utilizada debe cumplir al menos con los requisitos de disolvente de la espectrofotometría UV-visible; cuando se utiliza la detección de longitud de onda baja, también se debe considerar la longitud de onda de corte del disolvente orgánico en la fase orgánica y la cromatografía; Se deben seleccionar disolventes orgánicos de calidad. Los detectores de dispersión de luz evaporativa y los detectores de espectrometría de masas generalmente no permiten el uso de fases móviles que contengan componentes salinos no volátiles.

(3) Fase móvil El sistema de fase móvil puede utilizar una composición de disolvente con una proporción fija (elución isocrática) o una composición de disolvente que cambia la proporción según un procedimiento prescrito (elución en gradiente). Dado que no es fácil mantener la cadena C-18 en un estado extendido en un entorno acuoso, para un sistema de cromatografía de fase inversa en el que el gel de sílice unido a octadecilsilano es la fase estacionaria, la proporción de disolvente orgánico en la fase móvil normalmente debe ser no menos del 5%; de lo contrario, el enrollamiento aleatorio de las cadenas C 18 provocará cambios en los valores de retención de los componentes, provocando inestabilidad en el sistema cromatográfico.

2. Prueba de idoneidad del sistema

La prueba de idoneidad de un sistema cromatográfico suele incluir cuatro indicadores como son el número de platos teóricos, la resolución, la repetibilidad y el factor de cola. Entre ellos, la separación y la repetibilidad son parámetros más prácticos en las pruebas de idoneidad del sistema.

Las pruebas de idoneidad del sistema se suelen realizar en el sistema cromatográfico utilizando sustancias de referencia específicas.

(1) El número de platos teóricos de la columna cromatográfica (n) Bajo las condiciones cromatográficas especificadas, inyecte la solución de prueba o la solución de sustancia estándar interna, registre el cromatograma y mida el pico del componente principal o el tiempo de retención t R del pico de la sustancia patrón interno (medido en minutos o longitud, lo mismo a continuación, pero se debe usar la misma unidad) y el ancho del medio pico (W h/2), según n=5,54 (t R ／ W h/2 ) 2 Calcular el número de platos teóricos de la columna.

(2) Resolución (R) Ya sea que se trate de identificación cualitativa o análisis cuantitativo, se requiere tener una buena separación entre el pico a medir y otros picos, picos de estándar interno o picos de control de impurezas específicos. La fórmula de cálculo para la resolución es:

3) Repetibilidad Tome la solución de referencia e inyéctela 5 veces seguidas A menos que se especifique lo contrario, la desviación estándar relativa del valor del área del pico medido no debe ser superior al 2,0 %. También puede preparar una solución de referencia equivalente al 80 %, 100 % y 120 %, agregar la cantidad especificada de solución de estándar interno, preparar 3 soluciones con diferentes concentraciones, inyectar al menos 2 veces respectivamente y calcular el factor de corrección promedio. Su desviación estándar relativa no debe ser superior al 2,0%.

(4) Factor de cola (T) Para garantizar el efecto de separación y la precisión de la medición, se debe verificar si el factor de cola del pico a medir cumple con las regulaciones pertinentes.

3. Método de determinación

(1) Método estándar interno más factor de corrección para determinar el contenido de un determinado componente en la muestra de prueba. Pesar con precisión la sustancia de referencia y la sustancia de referencia. sustancia estándar interna, respectivamente, prepare una solución, mida con precisión cada solución y prepare una solución de referencia para la determinación del factor de calibración. Inyecte una cierta cantidad en el instrumento y registre el cromatograma. Mida el área del pico o la altura del pico de la sustancia de referencia y la sustancia estándar interna, y calcule el factor de corrección según la siguiente fórmula:

Factor de calibración (f) = fórmula (3-8)

Donde As en la fórmula es el área del pico o la altura del pico de la sustancia del estándar interno; A R es el área del pico o la altura del pico de la sustancia de referencia; C S es la concentración de la solución de la sustancia del estándar interno; de la solución de sustancia de referencia.

Tome la solución de prueba que contiene la sustancia estándar interna, inyéctela en el instrumento, registre el cromatograma, mida el área del pico o la altura del pico del componente a probar y la sustancia estándar interna en la muestra de prueba. y calcule el contenido de acuerdo con la siguiente fórmula:

Contenido (C x ) =f × Fórmula (3-9)

Donde A x es el área del pico o la altura del pico del producto de prueba; C x es la solución del producto de prueba La concentración de; A′ s es el área del pico o la altura del pico de la sustancia del estándar interno C′ s es la concentración de la sustancia del estándar interno; f es el factor de corrección.

Al preparar la solución de referencia para la determinación del factor de calibración y la solución de prueba que contiene la sustancia del estándar interno, use cantidades iguales de la solución de la sustancia del estándar interno de la misma concentración, C s = C′ s, luego la solución de referencia interna para la determinación del factor de calibración y la solución de prueba que contiene la sustancia del estándar interno. No es necesario pesar (medir) con precisión la solución estándar.

(2) El método estándar externo se utiliza para determinar el contenido de un determinado componente en la muestra de prueba, pesar (cantidad) con precisión la sustancia de referencia y la muestra de prueba, preparar una solución y tomar con precisión una determinada cantidad. cantidad de cada uno, inyéctelo en el instrumento y registre la imagen del cromatograma.

Dado que es difícil controlar con precisión el volumen de inyección con una microjeringa, cuando se utiliza el método estándar externo para determinar el contenido de un determinado componente en la muestra de prueba, es mejor utilizar un bucle cuantitativo o un Inyector automático para inyectar la muestra.

(3) El método de normalización de área consiste en medir el área de un determinado pico cromatográfico y los picos cromatográficos totales, excepto el pico de disolvente, en el cromatograma, y ​​calcular el porcentaje de un determinado pico cromatográfico en el total. área. Este método se utiliza habitualmente para comprobar la pureza de sustancias de referencia.

La solución antes de la inyección de la muestra de cromatografía líquida de alta resolución debe clarificarse, normalmente filtrada a través de una membrana microporosa (0,45μm).

(3) Cromatografía de gases (GC)

La cromatografía de gases utiliza un gas como fase móvil (gas portador) para fluir a través de una columna cromatográfica llena de cargas para el método de determinación cromatográfica. . Después de vaporizar la sustancia o su derivado, el gas portador la lleva a la columna cromatográfica para su separación. Cada componente ingresa al detector uno tras otro y la señal cromatográfica se registra con un registrador, integrador o sistema de procesamiento de datos.

La cromatografía de gases se usa ampliamente para fármacos crudos que contienen componentes volátiles. Tiene alta precisión y mejor efecto de separación que la cromatografía de capa fina. Sin embargo, los datos obtenidos solo tienen tiempo de retención. Alta temperatura si los componentes no se vaporizan, no se pueden analizar, por lo que el ámbito de aplicación es limitado. Aunque los componentes no volátiles se pueden analizar mediante derivatización o la aplicación de columnas de cromatografía especiales, son mucho menos convenientes y precisos que la cromatografía líquida de alto rendimiento. Según la "Farmacopea China" (edición de 2005), la cromatografía de gases se utiliza para el análisis de 47 tipos de medicinas tradicionales chinas, de los cuales 4 tipos de materiales medicinales se cuantifican mediante este método. Además, también se analizaron los residuos de pesticidas de dos materiales medicinales mediante el método GC.

1. Requisitos generales para los instrumentos

Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas portador, una parte de inyección de muestra, una columna cromatográfica, un horno de columna, un detector y un sistema de procesamiento de datos. . Las temperaturas de la sección de inyección, la columna y el detector están todas bajo control.

(1) Fuente de gas portador La fase móvil de la cromatografía de gases es gaseosa, denominada gas portador. Como gases portadores se pueden utilizar helio, nitrógeno e hidrógeno, que pueden ser proporcionados mediante cilindros de alta presión o de alta presión. Generadores de gas de pureza. Un dispositivo reductor de presión apropiado pasa a través del inyector y la columna cromatográfica a un cierto caudal; el gas portador se selecciona de acuerdo con la naturaleza de la muestra de prueba y el tipo de detector. El gas portador comúnmente utilizado es el nitrógeno.

(2) Parte de muestreo El método de muestreo generalmente puede utilizar inyección directa de solución o inyección de espacio de cabeza.

Para la inyección directa de la solución, utilice una microjeringa, una válvula de microinyección o una cámara de vaporización con un dispositivo divisor. Cuando se inyecte la solución directamente, la temperatura del puerto de inyección debe ser de 30 a 50 °C; mayor que la temperatura de la columna; el volumen de la muestra generalmente no excede unos pocos microlitros; cuanto menor sea el diámetro de la columna, menor debe ser el volumen de la muestra. Cuando se utiliza una columna capilar, el flujo generalmente debe dividirse para evitar la sobrecarga.

El muestreo de espacio de cabeza es adecuado para la separación y determinación de componentes volátiles en muestras de prueba sólidas y líquidas. La muestra de prueba sólida o líquida se convierte en una solución de prueba y se coloca en un vial sellado. Se calienta en una cámara de calentamiento con temperatura constante controlada hasta que los componentes volátiles de la muestra de prueba alcanzan el equilibrio en los estados gaseoso y no gaseoso. Absorbe automáticamente un cierto volumen de espacio de cabeza y lo inyecta en la columna cromatográfica.

(3) Columna cromatográfica La columna cromatográfica es una columna empaquetada o una columna capilar.

El material de la columna empaquetada es acero inoxidable o vidrio, con un diámetro interior de 2 a 4 mm y una longitud de columna de 2 a 4 m. Está llena de adsorbente, perlas porosas de polímero o un soporte recubierto con fijador. ~0,18 mm, 0,18~0,15 mm o 0,15~0,125 mm. Los vehículos comúnmente utilizados son tierra de diatomeas lavada con ácido y silanizada o perlas porosas de polímero, y los fijadores comúnmente utilizados incluyen metilpolisiloxano, polietilenglicol, etc. El material de la columna capilar es vidrio o cuarzo. La pared interior o soporte está recubierto o reticulado con fijador. El diámetro interior es generalmente de 0,25 mm, 0,32 mm o 0,53 mm. La longitud de la columna es de 5 a 60 m. El espesor es de 0,1 ~ 5,0 μm. Los fijadores comúnmente utilizados incluyen metilpolisiloxano, fenilmetilpolisiloxano, polietilenglicol, etc. en diferentes proporciones.

Las columnas empaquetadas y las columnas capilares nuevas deben envejecerse antes de su uso para eliminar los disolventes residuales y los polímeros de bajo peso molecular. Si la columna cromatográfica no se ha utilizado durante mucho tiempo, se debe envejecer antes de su uso para estabilizarla. la línea de base.

(4) Horno de columna Dado que la fluctuación de temperatura del horno de columna afectará la reproducibilidad de los resultados del análisis cromatográfico, la precisión del control de temperatura del horno de columna debe estar dentro de ±1 °C y la fluctuación de temperatura debe ser inferior a 0,1 ℃ por hora. El sistema de control de temperatura se divide en dos tipos: temperatura constante y aumento de temperatura programado.

(5) Detectores Los detectores adecuados para cromatografía de gases incluyen el detector de ionización de llama (FID), el detector de conductividad térmica (TCD), el detector de nitrógeno y fósforo (detector de nitrógeno-fósforo (NPD), el detector fotométrico de llama (FPD) , detector de captura de electrones (ECD), detector espectrométrico de masas (MSD), etc. El detector de ionización de llama responde bien a los hidrocarburos y es adecuado para detectar la mayoría de los compuestos; el detector de nitrógeno y fósforo tiene una alta sensibilidad a los compuestos que contienen elementos de nitrógeno y fósforo; el detector fotométrico de llama tiene una alta sensibilidad a los compuestos que contienen elementos de fósforo y azufre; son adecuados para compuestos que contienen halógenos; los detectores de espectrometría de masas pueden proporcionar información estructural correspondiente a un componente de la muestra de prueba y pueden usarse para confirmación estructural. Los detectores de uso común son los detectores de ionización de llama, que utilizan hidrógeno como gas combustible y aire como gas de soporte. Cuando se utiliza un detector de ionización de llama, la temperatura del detector generalmente debe ser superior a la temperatura de la columna y no inferior a 150 °C para evitar la condensación. vapor de agua, generalmente 250 ～ 350 ℃.

(6) El sistema de procesamiento de datos se puede dividir en registradores, integradores y estaciones de trabajo de cromatografía.

2. Prueba de idoneidad del sistema

Igual que la cromatografía líquida de alta resolución.

3. Método de determinación

(1) Método de estándar interno más factor de corrección para determinar el contenido de un determinado componente en la muestra de prueba.

(2) El método estándar externo se utiliza para determinar el contenido de un determinado componente en la muestra de prueba.

(3) Método de normalización de áreas.

Los contenidos específicos de los métodos anteriores (1) ~ (3) son los mismos que los métodos correspondientes de cromatografía líquida de alta resolución.

(4) Determine el contenido de un determinado componente en el producto de prueba agregando la solución estándar. Pese (cantidad) con precisión. Tome una cantidad adecuada de la sustancia de referencia de un determinado componente a medir. Prepare una solución de referencia de concentración adecuada. Tome una cierta cantidad y pésela con precisión a la solución de prueba, mida el contenido del componente a analizar de acuerdo con el método estándar externo o el método estándar interno y luego deduzca el contenido de. la solución de referencia agregada para obtener el contenido de un determinado componente a probar en la solución de prueba.

Para el análisis cuantitativo mediante cromatografía de gases, cuando se utiliza la inyección manual, debido a la influencia del tiempo de retención de la aguja y la temperatura ambiente en el volumen de inyección, es difícil controlar con precisión el volumen de inyección, por lo que es mejor utilizar el método de estándar interno para la cuantificación. Cuando se utiliza un muestreador automático, debido a la mejora en la repetibilidad de la inyección, también se puede utilizar el método de estándar externo para la cuantificación garantizando al mismo tiempo el error de inyección; Cuando se utiliza la tecnología de muestreo de espacio de cabeza, dado que la muestra de prueba y la sustancia de referencia no están exactamente en la misma matriz, se puede utilizar el método de adición de solución estándar para eliminar la influencia del efecto de la matriz cuando los resultados del método de adición de solución estándar son inconsistentes; con otros métodos cuantitativos, debe basarse en los resultados del método de adición estándar.

(4) Otros métodos de análisis cromatográfico

1. Electroforesis capilar de alto rendimiento (HPCE)

La electroforesis capilar de alto rendimiento es un tipo de electroforesis basada en tubos capilares. Canal de separación, una nueva tecnología de "cromatografía líquida" que utiliza un campo eléctrico de CC de alto voltaje como fuerza impulsora para realizar una separación eficiente y rápida en el tubo capilar de acuerdo con su movilidad o coeficiente de distribución. Es una combinación de tecnología de electroforesis clásica y. Producto moderno de separación de microcolumnas. Permite que la ciencia analítica pase del nivel de microlitros al nivel de nanolitros y hace posible el análisis de células individuales e incluso de moléculas individuales. Se ha convertido en la tecnología de análisis de separación más llamativa y de más rápido crecimiento en bioquímica y química analítica. desempeñan un papel cada vez más importante en la separación y análisis de muestras complejas.

2. Electrocromatografía capilar (CEC)

La electrocromatografía capilar combina las ventajas de la electroforesis capilar (CE) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se desarrolló tecnología de cromatografía líquida de microcolumna. CEC generalmente usa una columna capilar de cuarzo fundido, con una fase estacionaria llena la columna o unida a la pared del tubo. Se usa una fuente de alimentación de CC de alto voltaje (o una cierta presión externa) en lugar de una bomba de alta presión para generar electroosmótica. Flujo (EOF) en lugar de la fase móvil impulsada por presión, los solutos se separan en función de la diferencia en sus coeficientes de distribución entre la fase móvil y la fase estacionaria y la diferencia en su propia movilidad electroforética, por lo que puede separar tanto sustancias neutras como neutras. componentes cargados.

En los últimos años, se han realizado muchos intentos de analizar los componentes químicos de fármacos crudos mediante electroforesis capilar de alto rendimiento y electrocromatografía capilar, y se han logrado avances significativos.