¿Cuáles son los equipos generales y las técnicas operativas básicas para el cultivo de hongos medicinales?
El equipo básico y las técnicas operativas para cultivar hongos medicinales son los mismos que los del cultivo microbiano general.
1. Equipo general
(1) Sala estéril (sala de inoculación)
Este es un lugar para operaciones asépticas. Las salas estériles tienen requisitos estrictos. Generalmente tienen un tamaño de 4 a 5 metros cuadrados y las paredes deben estar pintadas de blanco. La habitación debe estar limpia y ordenada y no debe haber aire por convección. En el interior se deben instalar lámparas ultravioleta para desinfección y fluorescentes para iluminación, así como mesas de operaciones y taburetes. Es mejor tener una sala de amortiguamiento del doble de tamaño fuera de la sala estéril para evitar que el aire exterior entre en la sala estéril. Las puertas de las dos habitaciones no deben abrirse una frente a la otra, sino que deben abrirse de izquierda a derecha.
(2) Caja estéril
La caja estéril, también conocida como caja de inoculación (gabinete), es una vitrina de madera y vidrio que reemplaza la sala estéril. Hay válvulas en ambos lados de la caja que se pueden abrir y cerrar, y hay dos orificios circulares para las manos en la parte superior de la parte inferior frontal de la caja, para que pueda insertar las manos durante la vacunación. Lo mejor es presionar una lámpara ultravioleta y una lámpara fluorescente en la pared superior de la caja. Las esquinas de la caja esterilizada deben estar ajustadas y no debe haber espacios para evitar la invasión de bacterias extrañas.
La sala y caja estériles deben desinfectarse antes de su uso.
(3) Banco de trabajo limpio
Este también es un dispositivo para operación aséptica. Hay varios modelos y especificaciones, algunos adecuados para operación de una sola persona y otros adecuados para dos personas. operación. Se puede instalar en una habitación estéril o en una habitación general, pero se requiere que el flujo de aire ambiental sea pequeño, seco y polvoriento, y es mejor que no haya gente moviéndose. Este dispositivo se utiliza actualmente ampliamente en la investigación de cultivos microbianos y de tejidos.
(4) Equipo de esterilización
Se requiere un esterilizador de vapor de alta presión. Si las condiciones no son suficientes, se puede utilizar un vaporizador. Se utiliza principalmente para la esterilización de medios de cultivo y cristalería.
(5) Incubadora y sala de cultivo
Se utiliza para cultivo aislado. Elija diferentes equipos según los diferentes usos. Generalmente, el cultivo de especies madre de hongos medicinales se realiza en incubadora, mientras que el cultivo de cuerpos fructíferos requiere el uso de una cámara de cultivo. Durante la etapa física del hijo mayor la humedad del aire es alta, por lo que lo mejor es contar con piscina de cemento, fuente de agua, alcantarillado y ventilación. Además, hay portabotellas, luces, termómetros e higrómetros, etc.
(6) Equipos de secado
Hornos, salas de horneado, etc.
(7) Cristalería común
1. Tubos de ensayo
Se utilizan para cultivar cepas inclinadas. Comúnmente utilizado en 180×20mm y 150×15mm.
2. Matraz Erlenmeyer
Disponible en especificaciones de 100ml, 500ml, 1000ml, 5000ml. Se utiliza para contener agua estéril y medios de cultivo.
3. Placa de Petri
Para cultivo en avión. Lo más utilizado es una placa de Petri con un diámetro de 9 cm.
Pipeta
Se utiliza para diluir y aislar cepas. Disponible en 1ml y 10ml.
5. Embudo de vidrio
Se utiliza para filtrar y dispensar medio de cultivo.
6. Lámpara de alcohol
Se utiliza para la esterilización por llama de instrumentos de vacunación.
7.Otros suministros
Gasas, algodón, pinzas, tijeras, hilo, gradilla para tubos de ensayo, balanza, portaobjetos, cubreobjetos, microscopio, etc. Todavía es necesario.
Si se realiza la fermentación sumergida, además de los equipos anteriores, también existen equipos relacionados como matraces de agitación, tanques de semillas, tanques de fermentación, placas y marcos o centrífugas para filtración.
2. Técnicas básicas de funcionamiento
(1) Preparación y limpieza de la cristalería
El hecho de que la cristalería esté limpia o no afecta directamente a los resultados experimentales. Debe limpiarse o desinfectarse antes de su uso y secarse o secarse al sol para su uso posterior. La cristalería recién comprada contiene sustancias alcalinas libres. El mejor método de lavado es tratarlo una vez con una solución de 1 HC1 y luego lavarlo con agua limpia.
1. Preparación de solución limpiadora de dicromato potásico
Método de concentración:
Dicromato potásico (uso industrial) 40 gramos
800ml de concentrado ácido sulfúrico (para uso industrial)
160ml de agua del grifo
Método de igualación de diluciones:
50g de dicromato de potasio (para uso industrial)
100 ml de ácido sulfúrico concentrado (para uso industrial)
250 ml de agua del grifo
Disolver dicromato de potasio en agua, agregar lentamente ácido sulfúrico concentrado sin dejar de remover (cuidado no disolver el dicromato) La solución de ácido potásico se vierte en ácido sulfúrico concentrado para evitar quemaduras). Cuando esté listo, guárdelo en frascos, bien tapado con tapones y reserve. Al utilizar esta solución, el recipiente debe estar seco y tener cuidado de no introducir una gran cantidad de sustancias reductoras. La solución preparada es roja, viscosa y tiene pequeños cristales rojos.
2. Limpiar diversos utensilios de vidrio
Los recipientes contaminados con bacterias o que contienen hongos medicinales se esterilizan primero en un autoclave durante 20-30 minutos y luego se vierten mientras están calientes el cultivo y luego se lavan con agua caliente con jabón. No hay gotas de agua colgando de la pared de la botella.
Los recipientes que contienen vaselina y cera deben desengrasarse previamente, hervirse con una solución de soda al 5% si es necesario y luego lavarse con agua caliente y jabón. Si se realizan pruebas de precisión o se cargan productos químicos, se deben remojar en líquido de lavado, lavar con agua del grifo y agua destilada y secar para su uso posterior.
Las pipetas que contienen bacterias deben esterilizarse inmediatamente con una solución de ácido carbólico 5 durante un día y luego enjuagarse con agua del grifo.
Primero, remoje los nuevos portaobjetos y cubreobjetos en agua con jabón (o alcohol de ácido clorhídrico) durante 65, 438±0 horas, enjuáguelos con agua, séquelos con un paño suave y guárdelos en un medio con alcohol al 95%.
(2) Preparación del medio de cultivo
El medio de cultivo es una sustancia orgánica preparada artificialmente a base de diversos nutrientes necesarios para el crecimiento y reproducción de los hongos medicinales. Además de contener agua, carbohidratos, compuestos nitrogenados y pequeñas cantidades de sales inorgánicas, en ocasiones se requieren diversas vitaminas esenciales.
La fuente de carbono es una fuente importante de nutrientes para los hongos medicinales. No sólo es un componente importante en la síntesis de carbohidratos y aminoácidos, sino también una fuente de energía para las actividades vitales.
El nitrógeno es una materia prima importante para la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos. Las diferentes etapas de crecimiento y desarrollo de los hongos medicinales requieren diferentes proporciones de carbono y nitrógeno. La etapa de crecimiento vegetativo requiere una proporción de carbono-nitrógeno de aproximadamente 20:1; la etapa de crecimiento reproductivo requiere una proporción de carbono-nitrógeno de 30:1-40:1. Los diferentes hongos medicinales tienen diferentes requisitos en cuanto a la relación carbono-nitrógeno. Hay dos factores que determinan la relación carbono-nitrógeno: uno es la relación carbono-nitrógeno de los componentes intracelulares y el otro es la capacidad de diferentes hongos para asimilar elementos de carbono y nitrógeno.
Algunas sales inorgánicas, como los fosfatos y sulfatos de potasio, sodio, calcio y magnesio, son beneficiosas para el crecimiento y desarrollo de los hongos medicinales, aunque se utilizan en pequeñas cantidades. La tiamina (vitamina B1) es un componente importante de la carboxiltransferasa en el metabolismo del carbono, por lo que se deben considerar las necesidades nutricionales de los hongos medicinales al formular medios de cultivo.
Hay muchos tipos de medios de cultivo. Los medios de cultivo hechos de materia orgánica natural rica en nutrientes, como patatas, salvado, polvo de torta de frijoles, etc., se denominan medios de cultivo naturales. Los medios de cultivo preparados con sustancias químicas de composición y cantidad conocidas son medios sintéticos, como el medio de Charcot. Sin embargo, generalmente se utilizan algunas sustancias naturales como fuente de carbono, nitrógeno y factores de crecimiento, y se añaden adecuadamente algunas sales inorgánicas, lo que se denomina medio semisintético, como 200 g de patatas peladas, 20 g de glucosa, 1,5 g de dihidrogenofosfato de potasio, y 0,75 de sulfato de magnesio g; vitamina B110 mg, agar 18 g, agua 1000 ml.
Además de cumplir las condiciones nutricionales de los hongos medicinales, el medio de cultivo también debe prestar atención a ajustar el valor de pH adecuado. Hay dos tipos de medios de cultivo comúnmente utilizados: sólidos y líquidos.
(3) Desinfección y esterilización
Para aislar los hongos medicinales necesarios y realizar un cultivo puro, los utensilios y medios de cultivo utilizados deben estar estrictamente esterilizados para matar los microorganismos que contienen.
1. Método de esterilización por calor seco
Principalmente en el horno. Adecuado para cristalería como pipetas, placas de Petri, tubos de ensayo y matraces. Antes de la esterilización, la cristalería debe envolverse en papel y la temperatura debe controlarse a 65438 ± 060 ℃ durante 65438 ± 0 horas. Los artículos desinfectados sólo se pueden sacar cuando la temperatura desciende por debajo de los 60°C para evitar una caída brusca de temperatura y estallidos de los utensilios.
2. Esterilización por calor húmedo
Debido a que el poder de penetración del calor húmedo es más fuerte que el calor seco, este método se utiliza para medios que contienen agua. Generalmente, la presión de los medios de cultivo líquidos y de agar es de sólo 15 libras durante media hora, mientras que el tiempo de esterilización de los medios de cultivo de aserrín es el doble.
3. Esterilización aborigen
Cocer al vapor en una vaporera (u olla común y corriente). Esto generalmente se hace cuando las condiciones de autoclave no están disponibles o el autoclave destruye el medio de cultivo. La temperatura sólo puede alcanzar unos 100 ℃. Para lograr el propósito de una esterilización completa, generalmente es necesario realizar tres esterilizaciones intermitentes, manteniéndolo durante 1 hora después de cada ciclo, luego dejándolo a temperatura ambiente durante un día y vaporizándolo nuevamente el segundo y tercer día.
4. Esterilización de medicamentos
Los más utilizados incluyen alcohol al 70%, 0,1 litro de agua con mercurio, polvo blanqueador al 10%, solución de formaldehído al 40% y clormetionina.
Además, existen esterilización por llama y esterilización ultravioleta.
(4) Inoculación y cultivo
Hay muchos microorganismos en el aire, lo que es perjudicial para el cultivo puro de hongos medicinales. La inoculación debe realizarse en condiciones estériles.
1. Inoculación inclinada
Al inocular, coloque el medio de cultivo uno al lado del otro sobre el tubo de ensayo a inocular y la superficie inclinada de la cepa original en su mano izquierda, de manera que su dedo medio está intercalado entre los dos tubos de ensayo y la superficie inclinada hacia arriba para facilitar la observación. Sostenga la aguja de inoculación en su mano derecha, sumérjala en alcohol y quémela en la llama por un momento (la parte por donde ingresa la aguja de inoculación); El tubo de ensayo se quemará), use el dedo meñique, el anular y la palma de la mano derechos para sacar el tapón de algodón del tubo de ensayo y use la llama para hornear ligeramente la boquilla. Durante una semana, cualquier bacteria que pueda estar contaminada por la boquilla puede morir quemado. En este momento, se introduce la aguja de inoculación en el tubo de la cepa bacteriana a través de la llama, se enfría ligeramente, recoge unas cuantas hifas junto con el medio de cultivo, lo transfiere rápidamente al tubo de ensayo a inocular y lo coloca en el centro de la pendiente para facilitar el crecimiento y extensión de las hifas circundantes. Tenga cuidado de no utilizar las bacterias en contacto con la pared del tubo, y luego se inserta un tapón de algodón, completando así el proceso de inoculación del primer tubo. Cada tubo fue inoculado como anteriormente. Generalmente, cada tubo de cepa original se puede ampliar con 20 tubos nuevos y cultivar en una incubadora o incubadora.
2. Inoculación líquida
Es decir, la cepa se transfiere del medio inclinado al medio líquido, y luego se coloca en condiciones adecuadas para el cultivo con agitación. El método de vacunación es básicamente el mismo que antes. El tubo de deformación se puede colocar en el marco de deformación, los tornillos se aprietan en un cierto ángulo y el matraz triangular se inclina ligeramente hacia arriba para evitar que el líquido base fluya. Al enviar la espátula de inoculación que contiene las bacterias al medio de cultivo líquido, use la parte posterior de la espátula para aplastar la masa bacteriana en la pared de la botella cerca del medio de cultivo y colóquela en el líquido. Al mismo tiempo, tape el algodón. Enchufe y herramienta de inoculación. Cada tubo de bacterias puede contener de 2 a 3 botellas de solución de cultivo.
Si la cepa es líquida generalmente se inocula con una pipeta esterilizada y el volumen de inóculo es 10. Después de la inoculación, colóquelo en una coctelera en una sala de cultivo a temperatura constante para agitar el cultivo.
3. Herramientas y operaciones generales para operaciones en exterior
El cultivo en exterior se refiere al cultivo de polidactilia. Las herramientas más utilizadas incluyen hachas, sierras, taladros, raspadores y películas plásticas. Es necesario controlar la profundidad del corte y es mejor llegar ligeramente al xilema, lo que favorece el crecimiento de bacterias. La inoculación debe realizarse inmediatamente después del corte o punzonado para garantizar la calidad de la inoculación.