Red de conocimientos sobre prescripción popular - Enciclopedia de Medicina Tradicional China - Propuesta de Tesis de Graduación en Farmacia (2)

Propuesta de Tesis de Graduación en Farmacia (2)

Propuesta 3 de Tesis de Graduación en Farmacia

Título: Efecto del sen sobre la producción de orina en ratones

Estado de la investigación:

Primero, pululanasa

La pululanasa (EC.3.2.1.41) es una enzima que puede escindir específicamente los puntos de ramificación de la amilopectina. -1,6 enlaces glicosídicos, cortando así toda la rama lateral para formar la enzima desramificadora de amilosa. La pululanasa también descompone el pululano. La pululanasa se deriva de microorganismos, mientras que la enzima R se deriva de plantas. La pululanasa fue obtenida por primera vez por Bender y Wallenfels en 1961 a partir de Aerobacillus aerogenes (Klebsiella pneumoniae es una bacteria típica), e informaron sobre las buenas propiedades enzimáticas de esta enzima. Después de eso, investigadores de varios países obtuvieron pululanasa de diferentes regiones y microorganismos a través de una investigación extensa y profunda, lo que desencadenó un clímax en el desarrollo de la pululanasa.

En la industria procesadora de almidón, la amilasa es la más utilizada. ¿Su función es la de hidrolizar el almidón? -1,4 enlaces glicosídicos, cuando se usa solo, el producto contiene grandes cantidades de dextrina ramificada, incluidas grandes cantidades? -1,6 enlace glicosídico. ¿Qué pasa si no agrego almidón? Si el enlace glicosídico -1,6 se descompone por completo, inevitablemente provocará un enorme desperdicio. ¿Existe algo en la naturaleza que pueda descomponer el almidón? -1,6 bondasa glicosídica, comúnmente conocida como enzima desramificante. ¿Viudo? -1,6-glucosidasa (e.c3.2.1.68, oligo-l, 6-glucosidasa), pululanasa (e.c3.2.1.41 pululanasa), isoamilasa (e.c3.2.1.41 pululanasa) .Pulululan- 6-glucanasa (e.c3.2.1.69, pululan-6-glucanasa), entre las cuales la pululanasa tiene los requisitos más pequeños en cuanto a la estructura molecular del sustrato, por lo que puede usarse en muchos países. Todos compiten por desarrollarse, pero Hasta ahora, sólo la empresa NOVO de Dinamarca tiene capacidad de producción de pululanasa. Mi país sólo importa pululanasa, pero su alto precio limita la aplicación de pululanasa en mi país. En la década de 1970 se desarrolló una bacteria productora de pululanasa, pero no sus propiedades enzimáticas. Adecuado para la producción Hasta el momento, no hay informes nacionales sobre la localización de la pululanasa en la industria de procesamiento de almidón, se requiere que las propiedades enzimáticas de la pululanasa sean resistentes a los ácidos y al calor, porque generalmente se usa el método de enzima externa. Debido a las limitaciones de la enzima utilizada, la pululanasa se puede agregar en cualquier paso de la reacción de dos pasos, pero se deben cumplir las condiciones de reacción anteriores. Por lo tanto, las propiedades enzimáticas de la pululanasa deben cumplir las condiciones existentes para la hidrólisis enzimática del azúcar. , a saber, resistencia al ácido y resistencia al calor.

2. Estado actual de la investigación de la pululanasa

1 Microorganismos productores de pululanasa

La pululanasa fue producida por primera vez por Bender. y Wallenfels en 1961 de Aerobacter

Producción de gas). Después de informar sobre el buen desempeño de la enzima, investigadores de varios países llevaron a cabo investigaciones extensas y profundas y obtuvieron la enzima de microorganismos en diferentes regiones, lo que desencadenó un clímax en el desarrollo de la pululanasa. Pero hasta el momento, aunque se ha descubierto que muchos microorganismos pueden producir pululanasa, debido a las limitaciones de las condiciones actuales de producción industrial (acidez y temperatura), la pululanasa producida por la mayoría de los microorganismos no tiene valor comercial. La siguiente es una breve introducción a las bacterias productoras de pululanasa.

1.1 Variante del hongo Bacillus cereus

Fue descubierto por Toshiyuki Takasaki de Japón en 1975. Esta cepa produce dos enzimas amilasa simultáneamente: ? -Amilasa y pululanasa. Las condiciones óptimas de reacción son pH 6 ~ 6,5, temperatura 50°C y la tasa de conversión máxima (almidón hidrolizado a maltosa) es aproximadamente 95%. Los estudios enzimáticos muestran que la enzima aún conserva la mayor parte de su actividad a pH 5 y 60°C. Las células vegetativas de esta cepa tienen forma de bastón, se agregan y crecen en cadenas cortas y desordenadas desiguales, son inmóviles, grampositivas y son. grampositivas durante la gemación. Las células no mostraron una expansión obvia. La temperatura óptima de crecimiento de esta cepa es de 30°C ~ 37°C, y la temperatura máxima de crecimiento es de 41°C ~ 45°C. Se pueden utilizar glucosa, manosa, maltosa, trehalosa, almidón y glucógeno.

1.2 Acidophilus pullulan-Bacillus pullulan en descomposición.

A principios de la década de 1980, la empresa danesa Novo obtuvo esta cepa y la pululanasa producida por esta cepa es resistente al calor.

(60 ℃), resistencia a los ácidos (pH 4,5). La empresa invirtió mucho en investigación y desarrollo y en noviembre de 1983. La empresa lo comercializa comercialmente con el nombre comercial Prornozyme en Japón y Europa.

Hoy en día, es la pululanasa más utilizada y producida. Bacilo sp. Lactobacillus acidolyticus tiene forma de bastón. Después de varias horas de fermentación sumergida, se pueden observar células agrandadas similares a protoplastos. Las células son relativamente estables y están llenas de cilindros o elipsoides. La reacción de Gram es positiva, crece bien a 37 ℃, no crece por encima de 45 ℃, pI-1 es superior a 6,5 y crece bien en medio de cultivo (pH 4,8 ~ 5,2) utilizando pululano como fuente de carbono.

1.3 Bacillus subtilis

En 1986, el japonés Yushiyuki Takasaki describió una cepa capaz de producir pululanasa resistente al calor y a los ácidos, denominada Bacillus subtilis TU. La enzima producida por esta cepa es una mezcla de pululanasa y amilasa. El almidón hidrolizable es maltotriosa y maltotriosa. La pululanasa hidrolizable es maltotriosa. El pH óptimo de la pululanasa es de 7,0 a 7,5, pero también tiene aproximadamente un 50 % de actividad enzimática a un pH de 5,0. , y la temperatura óptima de esta pululanasa es 60°C.

1.4 Clorsulfurón-metilo resistente al calor

En 1987, E.madi de Alemania informó sobre una cepa que podía producir simultáneamente α-amilasa, pululanasa y glucoamilasa: Clostridium thermophila resistente y azufre- produciendo bacterias. La pululanasa producida por esta cepa tiene un amplio rango de adaptación a la temperatura (40°C ~ 85°C) y tiene alta actividad a pH 4,5 ~ 6,0. Sin duda ampliará los campos de aplicación de esta pululanasa.

1.5 Bacillus naganoensis, Bacillus deramificans, Bacillus. Pululano ácido

En la década de 1990, Deweer descubrió un bacilo productor de pululanasa. Tomimura descartó Mycobacterium tuberculosis. Las propiedades enzimáticas de la pululanasa producida por estas dos cepas son similares a las de Bacillus spp. Estas dos cepas son moderadamente acidófilas y no crecen por encima de un pH de 6,5 ni por encima de los 45°C. El descubrimiento de estas dos cepas de bacterias productoras de pululanasa amplió aún más el ámbito de aplicación de la pululanasa.

1.6 Bacterias termófilas productoras de pululanasa

Desde la década de 1980, la gente se ha dado cuenta gradualmente de que es difícil detectar la pululanasa extremadamente resistente al calor en condiciones naturales normales. llevó a científicos de todo el mundo a centrarse en la detección de bacterias termófilas en aguas termales, y ahora se han logrado más resultados. La temperatura óptima para la producción de pululanasa por Bacillus vorcaldarius y otras especies de Bacillus es de 75 ~ 85 ℃, y el pH óptimo es 6,3. La temperatura óptima y el valor de pH óptimo del Thermus termófilo marino son 90 °C y 6,0 respectivamente, y la temperatura óptima y el valor de pH óptimo de Thermus thermophilus son 75 °C y 5,5 respectivamente. La temperatura óptima y el valor de pH óptimo son 80 ~ 85 ℃. y 6,0 respectivamente.

2. Estructura molecular de la pululanasa

Hasta el momento se han clonado muchos genes de pululanasa, pero no hay ningún informe sobre la estructura de la pululanasa. Sin embargo, según la clasificación de las hidrolasas de enlaces de azúcar basada en la similitud de secuencia, la pululanasa pertenece a la familia 13. La familia de las amilasas contiene más de 30 enzimas, que se pueden dividir en hidrolasas y transferasas. Las isomerasas se dividen en tres categorías. ¿Pueden estas enzimas hidrolizarse y sintetizarse? ~1.4,?~1.6,?~1.2,?~1.3,?~1.5,?~ 1.1 Enlace glicosídico. Se han informado las estructuras de muchas de estas enzimas, y todas adoptan (?/?)8. A través de la investigación bioinformática, todas las proteínas de esta familia tienen la misma estructura y el centro activo de la enzima es (?/?)8 veces. La estructura del tubo se denomina dominio A. La mayoría de las enzimas de la familia 13 también tienen el dominio B, que se encuentra en el tubo plegado (?/?) de 8, el tercero. ¿Laminar y tercero? Las secuencias entre hélices se caracterizan por grandes diferencias en estructura y longitud, y se especula que sus funciones están relacionadas con la unión al sustrato. Inmediatamente después del pliegue (?/?)8, todavía está el dominio c, seguido del dominio c, y algunos miembros de la familia también tienen el dominio d.

3. Aplicación de la pululanasa

La pululanasa es un coadyuvante de preparación y procesamiento de enzimas ampliamente utilizado en la industria alimentaria. Descompone específicamente las moléculas de amilopectina y glucógeno en el almidón y sus ramas de oligosacáridos derivados. ~ Los enlaces glicosídicos 1,6 rompen la estructura ramificada y forman amilosa de diferentes longitudes. Por tanto, cuando esta enzima se combina con otras enzimas amilasas, el almidón puede sacarificarse por completo.

En los últimos años la pululanasa, como nuevo tipo de amilasa, se ha utilizado en la alimentación y otros sectores industriales que utilizan almidón como materia prima. Tiene las siguientes funciones en la industria alimentaria:

3.1 Utilización de la pululanasa sola. La amilopectina se convierte en amilosa.

La amilosa tiene las características de coagulación y fácil formación de gel estructuralmente estable, y puede usarse como una película resistente para envasado de alimentos. Esta película es adecuada como capa protectora para alimentos porque tiene un buen aislamiento del oxígeno y la grasa y tiene buenas propiedades de recubrimiento. También es adecuado para la fabricación de caramelos blandos de almidón y también se puede utilizar como espesante de mermelada, para rellenar alimentos con alto contenido de aceite, evitar fugas de aceite y procesar alimentos cárnicos. En los últimos años se han impulsado las películas biodegradables en la industria alimentaria, y la amilosa tiene grandes perspectivas de desarrollo en estos aspectos. Los frijoles tienen un mayor contenido de amilosa, por lo que los fideos elaborados con almidón de frijol mungo tienen mejor dureza que otros almidones. Si el almidón de cereal se trata con pululanasa y luego se convierte en amilosa, se pueden preparar fideos de alta calidad. En el almidón de cereales general, el contenido de amilosa representa sólo el 20% y el contenido de amilopectina es aproximadamente el 80%. Por cada tonelada de amilosa producida en la industria, hay 4 toneladas de amilopectina como subproducto. Aunque Estados Unidos ha obtenido una nueva variedad de maíz que contiene un 60% de amilosa mediante mejoramiento genético, no es adecuada para la producción a gran escala. La pululanasa se ha utilizado para cambiar la estructura del almidón en el exterior y puede convertir la amilopectina en amilosa. Se informa que el rendimiento puede alcanzar el 100% con este método. El método para producir amilosa es: primero use pululanasa para descomponer las ramas licuadas y convertirlas en amilosa, y luego use butanol o enfriamiento lento para precipitar el almidón. Luego se recupera el precipitado cristalino que contiene una pequeña cantidad de agua y, finalmente, se produce amilosa en polvo mediante secado por aspersión a baja temperatura.

3.2 Pululanasa y? ~ (13) Producción de amilasa en puré

La maltosa es un producto de azúcar con almidón tradicional en mi país. Contiene una cierta cantidad de maltosa y se usa ampliamente en dulces, pasteles y otras industrias alimentarias. ¿Cuál es el método de producción actual? ~ ¿Licuefacción y reutilización de amilasa? ~La amilasa hidroliza la amilopectina y sólo puede hidrolizar las cadenas laterales. ¿Cerca de la posición cruzada? La reacción de hidrólisis se detiene cuando el enlace glicosídico es ~1,6. Sin embargo, si se usa pululanasa para la hidrólisis simultánea, se pueden romper las cadenas ramificadas, se puede aumentar el grado de hidrólisis de la amilasa y se puede reducir el grado de hidrólisis de la amilasa. El contenido de dextrina límite aumenta en gran medida el rendimiento de maltosa, lo que resulta beneficioso para la producción de jarabe de maltosa. Actualmente se han llevado a cabo experimentos a gran escala sobre la sacarificación de pululanasa.

Las condiciones de la prueba son las siguientes. La cantidad de alimentación de cada lote es de aproximadamente 900 kg de arroz partido y la concentración de lechada es de 15 ~ 16be? La dosis para la piel es del 1,5% (para arroz partido). ~ (13) La actividad de amilasa es superior a 2000 unidades/g, la actividad de pululanasa con pH 5,8 es de 45000 ~ 55000 unidades/g, producida por Aeromonas, y la dosis por lote es de 1 kg. Los resultados mostraron que, en comparación con el azúcar de control, el azúcar reductor aumentó en 65438 ± 04,8, el contenido de maltosa aumentó en 45,6 y el contenido de dextrina disminuyó en 26,7. En comparación con el jarabe de uva de alta concentración, el jarabe de maltosa de alta concentración tiene menos probabilidades de cristalizar y tiene baja higroscopicidad, por lo que se usa ampliamente en la industria alimentaria. La combinación de pululanasa y β-amilasa tiene un bajo coste y el rendimiento de maltosa alcanza aproximadamente el 70% o incluso más.

3.3 Se utiliza para la sacarificación enzimática de la cerveza.

La malta en la producción de cerveza no solo es la principal materia prima para elaborar cerveza, sino que también proporciona una rica fuente de enzimas para el proceso de elaboración de cerveza. ¿Cuáles son las principales enzimas que descomponen el almidón de la malta durante el proceso de sacarificación de la elaboración de cerveza? ~Amilasa,? ~ ¿Amilasa y descomposición del almidón? ~ 1,6 R-enzima (fitopulululanasa o pululanasa vegetal). ? ~ (2+) la amilasa descompone el almidón en maltosa (incluida una pequeña cantidad de maltotriosa y una cantidad muy pequeña de glucosa) y dextrina de bajo peso molecular mediante el efecto sinérgico con las otras dos enzimas amilasa. Esto da como resultado que el mosto tenga el contenido de azúcar ideal. Para ahorrar la cantidad de malta utilizada en la producción industrial, se utiliza la llamada sacarificación enzimática adicional, es decir, bajo la premisa de reducir la cantidad de malta utilizada, se aumenta la proporción de materias primas auxiliares de almidón y se seleccionan tipos apropiados de Se añaden preparaciones enzimáticas para esmaltar. Para sacarificar completamente la cebada y otros excipientes, ¿es necesario agregar alfa-amilasa para su descomposición? ~ 1,6 preparaciones de pululanasa de enlace glicosídico, etc. Cuando se utiliza α-amilasa sola, la producción de las tres capas de maltosa y malta es incompleta. ¿Qué hacer si el almidón se descompone? Si la actividad enzimática de ~1,6 enlaces glicosídicos es insuficiente, la descomposición del almidón es incompleta, lo que da como resultado un bajo contenido de azúcar fermentable y el grado de fermentación de la cerveza no puede cumplir con los requisitos. ¿Si se puede descomponer? ~ 1.4 y? El producto de reacción de la glucosilación amilasa con un enlace glicosídico de ~1,6 es la glucosa, que tiende a diluir el sabor del vino.

¿Utiliza pululanasa y? ~ (13) La amilasa es más eficaz y sus productos de descomposición son principalmente maltosa y una pequeña cantidad de maltopolisacárido. Cuando se utiliza sacarificación enzimática externa, la dosis de la preparación enzimática es: amilasa 6-7 unidades/g de cebada y arroz: proteasa 60-80 unidades/g, y agregue bromelina 10 ppm y pululanasa 50 unidades/g de cebada. Las tres preparaciones enzimáticas anteriores se añaden al comienzo de la sacarificación o alcoholización.

En resumen, la pululanasa tiene amplias perspectivas de desarrollo en la industria alimentaria como coadyuvante de preparación y procesamiento de enzimas.

Propósito e importancia de la investigación:

La industria de preparación de enzimas es una industria importante formada desde la década de 1970. En la actualidad, el valor de producción total de preparados enzimáticos en el mundo es de 654,38+00 mil millones de dólares estadounidenses, y el valor de producción de mi país es de aproximadamente 654,38+00 mil millones de RMB. Con la continua expansión de sus campos de aplicación y el desarrollo de nuevas especies de enzimas, este mercado se está desarrollando rápidamente. Sin embargo, la industria mundial de preparación de enzimas está casi monopolizada por unas pocas empresas extranjeras, entre las cuales la danesa Novartis representa casi la mitad de las ventas mundiales totales. Esta investigación es de gran importancia para el desarrollo de la pululanasa y el desarrollo de la industria de preparación de enzimas.

En segundo lugar, mi país comenzó a investigar y desarrollar la pululanasa en la década de 1970. Sin embargo, la pululanasa desarrollada no era resistente al calor ni a los ácidos, lo que limitó su aplicación industrial. Para cambiar la dependencia de nuestro país de los productos importados, llenar los vacíos en este campo y encontrar un camino de localización, el propósito de este estudio es utilizar recursos microbianos naturales (pululanasa) para mejorar la tasa de utilización de materias primas de almidón en nuestro país. mejorando así la productividad general de la industria procesadora de almidón es de evidente importancia para la industria procesadora de almidón de mi país.

Contenido de la investigación (contenido, marco estructural, puntos clave y dificultades):

1. Detección de bacterias productoras de pululanasa

(1) Recolección de muestras;

(2) Cribado preliminar de cepas

(3) Recribado de cepas

(4) Métodos de conservación de cepas

(5) Establecimiento del método de determinación de la actividad enzimática.

2.Estudio sobre las condiciones de producción de pululanasa.

(1) Efecto de la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno en la producción de enzimas de fermentación:

(2) Efecto del pH inicial en la producción de enzimas;

(3) El efecto de la cantidad de inoculación en la producción de enzimas;

(4)El efecto de la temperatura de fermentación en la producción de enzimas;

(5)El efecto de los iones metálicos en la producción de enzimas.

Puntos clave o tecnologías clave:

(1) Aislamiento de cepas puras;

(2) Selección de métodos de identificación de cepas.

Métodos y medios de investigación:

1. Detección de bacterias productoras de pululanasa

(1) Recogida de muestras: elija un lugar adecuado (molino harinero, campos de hortalizas). , huertos, etc.) para recoger muestras de suelo.

(2) Detección preliminar de cepas bacterianas: diluir las muestras de suelo recolectadas con agua esterilizada, aplicarlas en una placa en un medio que contenga almidón, incubar a 37°C durante 48 horas y luego reaccionar con solución de yodo para el desarrollo del color, inocular colonias que contengan amilasa en la pendiente y conservarlas.

(3) Re-cribado de cepas: aplicar la cepa productora de amilasa aislada anteriormente en una placa de pululano, cultivarla a 37°C durante 48 horas y luego realizar una prueba de círculo transparente con etanol al 95%. . La producción de círculos transparentes indica que la cepa produce pululanasa. Las colonias que producen círculos transparentes se recogen y se cultivan en medio inclinado.

(4) Método de conservación de la cepa: conservación a baja temperatura a 4 ℃.

(5) Establecimiento del método de determinación de la actividad enzimática: centrifugar el caldo de fermentación, medir la absorbancia a 520 nm utilizando el método colorimétrico DNS, medir la curva estándar de glucosa y calcular la actividad de la pululanasa a partir de la curva estándar. .

2.Estudio sobre las condiciones de producción de pululanasa.

(1) Efecto de la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno en la producción de enzimas de fermentación: cultive con diferentes fuentes de carbono y nitrógeno durante un período de tiempo y mida la actividad enzimática. Otras condiciones son las mismas: volumen de inóculo, volumen de embotellado, valor de pH inicial, velocidad de rotación y tiempo de cultivo. )

(2) Efecto del pH inicial en la producción de enzimas: utilice el mismo medio de fermentación e inocule la misma cantidad de líquido de semilla con un pH inicial diferente. Cultive en las mismas condiciones y mida la actividad de la enzima. . Otras condiciones son las mismas: volumen de inóculo, volumen de embotellado, velocidad de rotación, temperatura óptima de cultivo y tiempo óptimo de cultivo.

)

(3) Efecto del volumen de inóculo en la producción de enzimas: inocular el medio de fermentación con 2%, 4%, 6% y 8% del volumen de inóculo,

10%, 14 Se cultivaron % y 18 % de líquidos de cultivo de semillas en el medio con fuente óptima de carbono, fuente de nitrógeno y pH inicial óptimo en las mismas condiciones, y se detectó la actividad enzimática respectivamente. (Utilice la fuente óptima de carbono, la fuente de nitrógeno y el pH inicial óptimo determinado anteriormente).

(4) Efecto de la temperatura de fermentación en la producción de enzimas: utilice el mismo medio de cultivo a diferentes temperaturas (25 °C, incubar durante un cierto período de tiempo a 30°C, 35°C, 40°C y 45°C, y medir la actividad enzimática.

(5) Efecto de los iones metálicos en la producción de enzimas: agregue una pequeña cantidad de diferentes iones metálicos al medio de cultivo basal y mida la actividad enzimática después de la fermentación. (Los iones metálicos incluyen: iones de manganeso, iones de calcio, iones de zinc, iones de magnesio, iones de hierro, iones de cobre).

Progreso de la investigación

: complete el 30% del progreso general del proyecto, muestras Recolección y preparación preliminar de muestras de suelo, selección preliminar de cepas, incluido (cultivo de recubrimiento y cultivo en mesa vibratoria de muestra de solución madre de suelo, selección de cepas productoras de pululanasa y cultivo inclinado).

50% del progreso general del proyecto, re-seguimiento de cepas, incluido (detección y cultivo inclinado de bacterias productoras de pululanasa), determinación de la curva estándar de glucosa, establecimiento del método de determinación de la actividad enzimática, según a la actividad enzimática Realice un nuevo análisis de la cepa bacteriana.

: Se completó el 80% del avance general del proyecto y se estudiaron las condiciones de producción de enzimas. Incluyendo fuente de carbono, fuente de nitrógeno, valor de pH inicial, tamaño del inóculo, temperatura de fermentación e iones metálicos. La fuente óptima de carbono, la fuente de nitrógeno, el valor de pH inicial, el tamaño del inóculo, la temperatura de fermentación y los iones metálicos del medio de fermentación se determinaron mediante experimentos de un solo factor.

2009, abril-mayo de 2009: El avance general del proyecto es del 100%, resumen del proyecto y redacción en papel.

Revisión de la literatura (que incluye: teorías de investigación nacionales y extranjeras, métodos de investigación, progreso, problemas existentes, bases de referencia, etc.)

La pulululanasa fue descubierta por primera vez en 1961 por Bender H. et al. Se descubrió por primera vez durante el estudio de un tipo de bacilo aerogenes (Klebsiella pneumoniae es una bacteria típica). Después de una extensa investigación sobre los microorganismos que producen esta enzima, se descubrió que muchos microorganismos pueden producir esta enzima y se descartaron algunas cepas excelentes adecuadas para la producción industrial. Con la aplicación y el desarrollo de esta enzima, la investigación sobre la pululanasa termoestable ha aumentado gradualmente y el gen de esta enzima se ha clonado y expresado con éxito. La pululanasa de una cepa de Aerobacter aerogenes 10016 se estudió en China del 65438 al 0976. Se informaron las condiciones de producción, aislamiento y extracción de la enzima y sus propiedades enzimáticas, y se estudió el proceso de extracción de la enzima de calidad alimentaria. Además, Chen, et al. examinaron una cepa termófila productora de pululanasa en muestras de agua termal en Yunnan. Mediante inducción y otros experimentos, la actividad enzimática aumentó de 0,069 u/ml a 1,70 U/ml y la producción de enzima aumentó aproximadamente 2500 veces. La temperatura óptima de esta enzima es 75 °C, el pH óptimo es 4,5 y tiene cierta resistencia al calor y a los ácidos.

Chen Jinquan y otros examinaron una cepa silvestre que produce pululanasa resistente al calor y a los ácidos a partir de muestras de agua termal. Con base en características morfológicas, características fisiológicas y bioquímicas, análisis de composición química celular, comparación de secuencia de 16SrDNA, porcentaje molar de ADN genómico G+C, comparación de homología y otros experimentos, se identificó como una nueva especie de Alicyclobacillus. La temperatura óptima para la producción de enzimas es. 60ºC. Yang Yunjuan y otros construyeron con éxito una cepa genéticamente modificada que expresa altamente la pululanasa utilizando Pichia pastoris. En condiciones óptimas de fermentación, la actividad de la enzima pululano en la fermentación en matraz agitado puede alcanzar 350,8 U/ml y el rendimiento puede alcanzar 504,5-510,1 U/ml. La temperatura óptima de la enzima es 60 °C, su pH óptimo es 4,5 y tiene buena resistencia al calor y a los ácidos. En la actualidad, no existe ningún fabricante nacional capaz de producir pululanasa de forma independiente y aún queda un largo camino por recorrer para lograr una producción localizada y de bajo costo.

La aplicación de la tecnología en la investigación de enzimas desramificantes termoestables ha supuesto grandes avances en la investigación de la isoamilasa termoestable. Coleman et al. clonaron el gen de la pululanasa de la bacteria anaeróbica termófila T. brockii en Bacillus subtilis, y la cantidad de pululanasa secretada por el clon fue mayor que la de la cepa original. Okada et al. clonaron el gen que codifica la isoamilasa termoestable de Bacillus stearothermophilus en Bacillus subtilis, y la isoamilasa de la cepa transformada fue estable a 60°C durante 15 minutos. Burchadf lo hará. El 38% de los genes de isoamilasa termófila se clonaron y expresaron en E. coli. El pH y la temperatura óptimos de la enzima obtenida fueron los mismos que los de la cepa inicial y aún podía mantener su actividad a altas temperaturas.

Antranikiam et al. clonaron el gen de la isoamilasa de Pyrococcus riousous en E. coli y aislaron la proteína enzimática. A pesar de esto, no ha habido informes sobre la aplicación de bacterias de ingeniería de isoamilasa transgénicas resistentes al calor en la producción industrial. Es bien sabido que el tratamiento de células microbianas con mutágenos físicos y químicos solos o en combinación es un método clásico y eficaz para seleccionar cepas mutantes de alto rendimiento. Ha desempeñado un papel extremadamente importante en el cultivo de cepas mutantes de alto rendimiento de diversos antibióticos, aminoácidos y nucleótidos quinasas (especialmente proteasas y amilasa), y sigue siendo uno de los métodos convenientes y eficaces.

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