Métodos experimentales para la formación de tumores en ratones desnudos
Células tradicionales más propensas a desarrollar tumores
Hep-G2 (cáncer de hígado), Hep2 (cáncer de laringe), NCI-H460 (cáncer de pulmón de células grandes), SK-OV- 3 (cáncer de ovario), MCF-7 (cáncer de mama) SKBR3, A375/B16-F10 (células de melanoma humano), SPC-A-1 (adenocarcinoma de pulmón), HT-29/HCT116 (cáncer de colon), BEL- 7402 (cáncer de hígado), MDA-100
Selección de ratones desnudos
Los ratones desnudos BALB/c-nu se utilizan comúnmente en laboratorios. A medida que los ratones desnudos envejecen o se ven afectados por factores relacionados (como una infección viral), la cantidad de células T normales en ratones desnudos aumentará. Por lo tanto, los ratones desnudos de 4 a 6 semanas de edad generalmente se utilizan para experimentos de inoculación de tumores.
Consejos para el experimento de formación de tumores en ratones desnudos
1. El estado de las células es la clave para los experimentos de formación de tumores, por lo que el estado de crecimiento de las células debe ser bueno. Tome las células en la fase de crecimiento logarítmico y tenga. es apropiada una densidad celular de 80 -90% aproximadamente. Reemplace con medio fresco la noche antes de recolectar las células.
2. Digerir las células con tripsina y lavarlas dos veces con PBS preenfriado para eliminar el suero residual en las células.
3. Utilice PBS o medio sin suero para soplar las células a la concentración adecuada. Generalmente, la cantidad de células para inocular tumores subcutáneos es de 1 a 5 x 106 células/tubo, y el volumen de inoculación es de 0,1 a 0,2 ml, por lo que la concentración de la suspensión celular es de 1 a 5 x 107 células.
4. Una vez digeridas las células, se deben inocular por vía subcutánea en ratones desnudos lo antes posible, generalmente en media hora (si la cantidad de inoculación es grande, se puede inocular en lotes). En el camino, la suspensión celular debe colocarse en hielo para reducir el metabolismo celular y mantener la actividad celular.
5. Los ratones desnudos seleccionados generalmente tienen entre 4 y 6 semanas de edad y pesan entre 16 y 18 g. El sitio de implantación se selecciona en un área con abundante suministro de sangre, como la axila media y trasera.
6. Utilice una pistola para soplar la suspensión celular antes de la inoculación para evitar la aglomeración celular y reducir la tasa de supervivencia celular, lo que resulta en diferencias excesivas en el número de células inoculadas en ratones.
7. Al inocular, la aguja debe insertarse un poco más profundamente en la piel, aproximadamente 1 cm de profundidad, y deslizarse hacia la izquierda y hacia la derecha debajo de la piel varias veces para inocular las células en un grupo y reducir la suspensión celular. rebosando del orificio de la aguja después de la inyección.
8. ¿Cómo proteger a los ratones desnudos? Pellizca la piel detrás del cuello del ratón desnudo con el pulgar y el índice izquierdos, y pellizca la cola del ratón desnudo con el dedo meñique.
9,1-2 semanas después de la vacunación, se pueden ver bultos duros que empiezan a aparecer debajo de la piel.
10. Dependiendo de las características de las células tumorales y del número de células inoculadas, el ciclo de formación del tumor subcutáneo es generalmente de 1-2 meses. Los tumores no deben crecer demasiado y generalmente no deben exceder los 2000 mm3.
11. El tamaño del tumor generalmente se mide dos veces por semana. 1. Mida las partes más largas y más cortas del tumor con un calibre. V=1/2ab2 (a es el eje largo, B es el eje corto).
12. Una vez extirpado el tumor subcutáneo, una parte del mismo se congela en nitrógeno líquido para su posterior extracción de proteínas y ARN, y otra parte se fija en formalina para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia.
Preguntas y respuestas frecuentes
1. ¿Por qué en este experimento se utilizaron ratones desnudos en lugar de ratones comunes o blancos?
La característica más importante de los ratones desnudos utilizados en experimentos de tumorigénesis en ratones desnudos es que no tienen órganos inmunes como el timo, y su inmunidad es casi nula. No tienen ningún efecto inmunológico sobre las células tumorales y son propensos a desarrollar tumores. formación.
2. ¿El tumor desaparecerá a medida que crezca?
Es muy común que las masas tumorales primero se reduzcan y luego crezcan, lo que probablemente sea una reacción inflamatoria. Las células tumorales fueron absorbidas por los propios ratones. Después de unas semanas, continúe observando si las células tumorales pueden crecer. Si no puede crecer, se recomienda reemplazarlo con un mouse.
3. ¿Se puede vacunar un ratón en varios puntos?
No, un ratón solo puede vacunarse en un momento dado, porque varios tumores en un ratón pueden afectarse entre sí.
4. ¿Por qué el tumor no puede volver a crecer?
En primer lugar, el ciclo de crecimiento del tumor es muy lento y tarda entre 1 y 2 meses en convertirse en tumor.
En segundo lugar, puede ser que el estado de las células sea deficiente, la viabilidad no sea buena o que las células tumorales no sean fáciles de formar tumores, y sea necesario agregar Matrigel para ayudar o aumentar la cantidad de inoculación. o cambiar la línea celular;
Tercero: Por un lado, puede ser que los ratones sean demasiado viejos o que los ratones tengan un rechazo inmunológico. Se recomienda reemplazar los ratones con mayores deficiencias inmunes (Nod-. ratones scid).
5. El tamaño del tumor varía mucho.
En primer lugar, no todos los tumores crecen de manera uniforme. En segundo lugar, puede no coincidir con la edad de los ratones y la cantidad de células inoculadas, por lo que se recomienda volver a inocular.