Principios técnicos de la proteómica
Electroforesis en gel bidimensional (2-DE)
La electroforesis en gel bidimensional y la espectrometría de masas son actualmente los métodos de investigación proteómica más utilizados. La electroforesis en gel bidimensional utiliza diferencias en el punto isoeléctrico de las proteínas y el peso molecular para distinguir varias proteínas. Aunque la electroforesis en gel bidimensional es difícil de identificar proteínas de baja abundancia y tiene altos requisitos operativos, tiene un alto rendimiento, alta resolución, buena reproducibilidad y se puede combinar con espectrometría de masas, lo que la convierte en la proteína ómica más popular y confiable en la actualidad. herramientas de investigación. El proceso de investigación proteómica basado en la tecnología de electroforesis en gel bidimensional y la tecnología de espectrometría de masas es preparación de muestras → enfoque isoeléctrico → electroforesis en gel de poliacrilamida → tinción de gel → extracción de puntos de proteínas de interés → digestión en gel → análisis y determinación de espectrometría de masas Huella peptídica o secuencia parcial de aminoácidos → identificación de proteínas mediante bases de datos. La investigación proteómica requiere una separación de proteínas de alta resolución y una tecnología de identificación por espectrometría de masas precisa y sensible. La coloración de las proteínas en la electroforesis en gel no solo afecta la resolución de la separación de proteínas, sino que también afecta la identificación posterior por espectrometría de masas. La tinción de proteínas se puede dividir en cuatro tipos: tinción de reactivos orgánicos, tinción de plata, tinción fluorescente y tinción de isótopos.
Unlu et al. propusieron un método de análisis proteómico cuantitativo mediante electroforesis bidimensional diferencial de fluorescencia (F-2D-DIGE). La electroforesis diferencial en gel (DIGE) es una mejora técnica del 2-DE. Combina múltiples métodos de análisis de fluorescencia para separar múltiples muestras marcadas con fluorescencia de manera diferente en el mismo gel e introduce estándares internos por primera vez. Las proteínas de las dos muestras se mezclan con diferentes marcadores fluorescentes y luego se utiliza 2-DE para detectar la expresión de las proteínas en las dos muestras, lo que mejora en gran medida la precisión, confiabilidad y repetibilidad de los resultados de la detección. En la tecnología DIGE, cada mancha de proteína tiene su propio estándar interno y el software puede calibrar automáticamente la expresión de cada mancha de proteína según el estándar interno para garantizar que los cambios en la abundancia de proteínas detectados sean reales.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Aunque la electroforesis en gel bidimensional (2-DE) es un método común para analizar todo el proteoma, adolece de una capacidad de separación e identificación limitadas. Desventajas como mala calidad y pasos de operación complicados. Chong et al. utilizaron cromatografía líquida de alta resolución/espectrometría de masas para analizar comparativamente la expresión diferencial de dos proteínas en tumores premalignos y cáncer. Las proteínas se separaron mediante cromatografía líquida de alta resolución y las fracciones recolectadas se caracterizaron utilizando MALDI-TOF-MS para cuantificar las proteínas expresadas diferencialmente en las dos células. Como nueva tecnología de separación, la cromatografía líquida multidimensional no está limitada por la masa molecular relativa y el punto isoeléctrico. Elimina el efecto de identificación de la electroforesis en gel bidimensional mediante la combinación de diferentes modos. Tiene las características de una gran capacidad máxima y una fácil automatización. La cromatografía bidimensional de intercambio iónico de fase reversa (2D-IEC-RPLC) es el sistema de separación por cromatografía líquida multidimensional más utilizado en la investigación de proteómica.
Espectrometría de masas de tiempo de vuelo
La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización y desorción láser mejorada en superficie (SELDI) fue inventada por Tanaka, el premio Nobel de química, en 2002. Ha despertado gran interés en la comunidad académica. SELDI es una plataforma ideal para la investigación proteómica y se denomina espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización y desorción láser de superficie mejorada (SELDI-tof). SELDI-tof). El método principal es: normalmente, la muestra se deja caer directamente sobre un chip con una superficie especialmente modificada después de un tratamiento previo simple, de modo que se puedan comparar las proteínas diferenciales entre las dos muestras y también se pueda obtener el perfil de proteínas total de la muestra. SELDI se puede utilizar para analizar muestras biológicas complejas porque las muestras no requieren purificación previa mediante cromatografía líquida o cromatografía de gases. SELDI puede analizar proteínas hidrófobas, proteínas de PI alto o bajo y proteínas de baja masa molecular (<25.000). También puede detectar muchas proteínas de baja concentración ocultas en muestras no tratadas, lo que aumenta la detección de proteínas que están enmascaradas en muestras no tratadas. . SELDI requiere solo una pequeña cantidad de muestra, puede obtener resultados en poco tiempo y tiene buena reproducibilidad. Es adecuado para el diagnóstico clínico y la detección a gran escala de biomarcadores relacionados con enfermedades, especialmente para la detección directa de orina, sangre y orina sin procesar. líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial de las articulaciones, líquido de lavado bronquial, lisados celulares y secreciones, por lo que puede detectar biomarcadores en muestras con PI alto o bajo, bajo peso molecular (<25.000) y también puede detectar muchos biomarcadores en muestras ocultas no procesadas. proteínas, aumentando así las posibilidades de descubrir biomarcadores.
Además, también puede detectar el peso molecular, PI, sitios de glicosilación, sitios de fosforilación y otros parámetros de la proteína objetivo en la muestra.
Etiqueta de afinidad isotópica (ICAT)
La etiqueta de afinidad isotópica (ICAT) es una tecnología utilizada para la separación y el análisis de proteínas, y es la tecnología central de la investigación proteómica. La técnica utiliza etiquetas de afinidad de isótopos (ICAT) de diferentes masas para marcar la cisteína en células de diferentes estados y luego analiza la muestra mezclada mediante espectrometría de masas en tándem. El mismo tipo de proteína de dos muestras formará dos formas de pico diferentes que pueden identificarse y compararse fácilmente, lo que permite una comparación muy precisa de los niveles de expresión de proteínas en las dos muestras. Los beneficios de ICAT son que puede detectar directamente muestras mixtas; puede identificar y cuantificar rápidamente proteínas de baja abundancia, especialmente proteínas hidrofóbicas como las proteínas de membrana, y puede identificar rápidamente proteínas funcionales importantes.
El uso de nuevos reactivos ICAT, combinados con cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem, no solo compensa en gran medida las deficiencias de la electroforesis bidimensional, sino que también hace que el análisis automatizado de proteomas de alto rendimiento sea más sencillo y más eficiente. Preciso. Más rápido y representa la principal dirección de desarrollo de la tecnología de análisis de proteoma. Para el análisis de proteínas fosforiladas, la propia tecnología ICAT, combinada con la tecnología de fase sólida, ha logrado muchos avances significativos y ahora ha formado la serie de tecnologías ICA T.
Tecnología bioinformática
La bioinformática desempeña un papel cada vez más importante en la investigación en ciencias de la vida. El uso de la bioinformática para procesar y analizar diversos datos del proteoma también es una parte importante de la investigación del proteoma. La bioinformática es una parte integral de la investigación en proteómica. El desarrollo de la bioinformática permite no sólo el análisis simple de datos genómicos y proteómicos, sino también el análisis integral de productos genéticos nuevos o conocidos. Toda la información de proteínas expresada por organismos, tejidos o células se almacena en la base de datos del proteoma. Esta información se puede obtener simplemente haciendo clic en los puntos de proteínas en el mapa de electroforesis en gel bidimensional con el mouse.