Tecnología de investigación proteómica

Se puede decir que el desarrollo de la proteómica está impulsado por la tecnología y limitado por la tecnología. El éxito de la investigación en proteómica depende en gran medida del nivel de sus métodos técnicos. La tecnología de investigación de proteínas es mucho más compleja y difícil que la tecnología genética. No sólo hay más tipos de residuos de aminoácidos que de nucleótidos (20/4), sino que además las proteínas presentan modificaciones postraduccionales complejas, como la fosforilación, la glicosilación, etc., que traen muchas dificultades a la separación y análisis de las proteínas. Además, los vectores de expresión dificultan la amplificación y purificación de proteínas in vitro, lo que dificulta la preparación de proteínas en grandes cantidades. El auge de la proteómica ha traído nuevas demandas y desafíos a la tecnología. El estudio de la proteómica es esencialmente la separación y el análisis masivo y paralelo de proteínas a nivel celular, lo que a menudo requiere el procesamiento simultáneo de miles de proteínas. Por lo tanto, desarrollar una plataforma tecnológica de investigación con alto rendimiento, alta sensibilidad y alta precisión es la principal tarea de la investigación en proteómica actualmente e incluso desde hace bastante tiempo. En la actualidad, la base técnica y las tendencias de desarrollo de la plataforma tecnológica internacional de investigación del proteoma son las siguientes: en términos generales, todos los componentes proteicos de las células o tejidos se pueden utilizar para el análisis del proteoma. Las muestras también se pueden preclasificar, es decir, las proteínas completas de las células o tejidos se dividen en varias partes mediante diversos métodos para estudios de proteomas separados. Los principales métodos para el fraccionamiento previo de muestras incluyen el fraccionamiento basado en la solubilidad de las proteínas y la ubicación de las proteínas en diferentes orgánulos, como la separación de componentes proteicos en orgánulos como el núcleo, las mitocondrias o el aparato de Golgi. La preclasificación de muestras no solo mejora el tamaño de la muestra y la detección de proteínas de baja abundancia, sino que también permite el estudio del proteoma de un orgánulo.

El estudio de muestras de tejido clínico y la búsqueda de marcadores de enfermedades es una de las direcciones de investigación importantes de la proteómica. Sin embargo, las muestras clínicas son una mezcla de varias células o tejidos con diferentes estados. Por ejemplo, en el tejido tumoral, las células epiteliales cancerosas a menudo se mezclan con vasos sanguíneos y células estromales del tumor. Por lo tanto, la comparación de las diferencias entre tejidos cancerosos y paracancerosos o tumores y tejidos normales es en realidad una comparación de mezclas de proteínas de varias células o incluso tejidos. Sin embargo, el estudio de las proteínas a menudo requiere un solo tipo de célula. Recientemente se han realizado nuevos avances en la preparación de muestras proteómicas a nivel tisular, como el aislamiento de células epiteliales cancerosas mediante microdisección por captura láser (LCM). La electroforesis en gel bidimensional que utiliza el punto isoeléctrico y el peso molecular de las proteínas es un método eficaz para distinguir varias proteínas. Desempeña un papel clave en las técnicas de separación para la formación de proteínas. Cómo mejorar la capacidad de separación, la sensibilidad y la resolución de la electroforesis en gel bidimensional y detectar con precisión la expresión diferencial de proteínas son cuestiones clave en el desarrollo de la tecnología de electroforesis en gel bidimensional. Las principales tendencias en el extranjero son el desarrollo de la separación en gel con gradiente de pH estrecho en electroforesis unidimensional y la tecnología de tinción de proteínas de alta sensibilidad combinada con electroforesis en gel bidimensional, como la nueva tecnología de tinción fluorescente.

La espectrometría de masas es la tecnología de mayor crecimiento, más dinámica y con mayor potencial en proteómica. Identifica el tipo de proteína midiendo su masa. La tecnología central de la investigación actual sobre proteomas es la electroforesis en gel bidimensional-espectrometría de masas, que separa las proteínas mediante electroforesis en gel bidimensional y luego identifica las proteínas una por una mediante espectrometría de masas. Para la identificación de proteínas, el alto rendimiento, la alta sensibilidad y la alta precisión son tres indicadores clave. Es difícil para la espectrometría de masas general combinar los tres, pero la espectrometría de masas desarrollada recientemente puede cumplir los tres requisitos anteriores al mismo tiempo, logrando así una identificación precisa y a gran escala de proteínas. Las personas que han realizado electroforesis en gel bidimensional definitivamente se quejarán de sus deficiencias, como complejidad, inestabilidad y baja sensibilidad. El desarrollo de nuevos métodos que puedan reemplazar o complementar la electroforesis en gel bidimensional se ha convertido en un objetivo importante de la tecnología de investigación del proteoma. Actualmente, nuevas tecnologías de separación como la cromatografía bidimensional (2D-LC), la electroforesis capilar bidimensional (2D-CE) y la cromatografía líquida-electroforesis capilar (LC-CE) tienen el potencial de complementar y reemplazar la electroforesis en gel 2D. Otra estrategia es utilizar la espectrometría de masas como núcleo y desarrollar nuevas estrategias como Shot-gun y CE-MS para identificar directamente los productos de hidrólisis enzimática mixta del proteoma. Con énfasis en la investigación de interacciones de proteínas a gran escala, los científicos también han comenzado a prestar atención al desarrollo de tecnología de detección de interacciones de proteínas de alto rendimiento y alta precisión. Además, los chips de proteínas se están desarrollando muy rápidamente y se han utilizado en el diagnóstico clínico.

Bioinformática del proteoma

La base de datos de proteomas es el símbolo y la base del nivel de investigación del proteoma. Swiss PROT alberga la base de datos de proteomas más grande y diversa del mundo. Países como Dinamarca, el Reino Unido y los Estados Unidos también han creado sus propias bases de datos de proteomas. El desarrollo de la bioinformática ha proporcionado software de análisis informático más conveniente y eficaz para la investigación del proteoma. Vale la pena señalar particularmente que el software y los algoritmos de identificación de espectrometría de masas de proteínas se están desarrollando rápidamente. Por ejemplo, el PROT suizo, la Universidad Rockefeller y la UCSF tienen su propio software de búsqueda y sistemas de gestión de datos. Los avances recientes en la búsqueda directa de bases de datos genómicas con datos de espectrometría de masas han hecho posible anotar genes directamente y determinar métodos de empalme complejos. Con el rápido desarrollo de la genómica, se proporcionarán bases de datos cada vez más completas para la investigación del proteoma. Además, el software de secuenciación de novo etiquetado con secuencias peptídicas también resulta de gran interés.