Cultivo de referencia de células estrelladas hepáticas
1.1 Preparación del animal Ratas SD macho, que pesan unos 500 g, se alimentan con pienso convencional y beben agua con normalidad. Tome vitamina A Mina diariamente durante 2 semanas antes del aislamiento de HSC.
Inyectar 200UI/100g en la sonda gástrica.
1.2. Principales reactivos e instrumentos
1.2.1 Reactivos: Colagenasa
IV. Pronasa, VEGF de ratón, desoxirribonucleasa, medio RPMI1640, suero fetal bovino, suero de caballo, Percoll.
1.3 Aislamiento y purificación de células estrelladas hepáticas
El día del aislamiento, anestesiar con inyección intramuscular de ketamina (0,2ml/100g) y heparina (150UI), y luego desinfectar estrictamente . Colóquelo sobre una mesa limpia y esterilizada y fíjelo en posición supina. Canulación y perfusión de la vena porta después de laparotomía. La operación específica es la siguiente: hacer una gran incisión transversal, que se extiende hasta la apófisis xifoides, hasta la sínfisis púbica y hacia los lados izquierdo y derecho de la línea axilar media bilateral. El colgajo se evierte, exponiendo todos los órganos dentro de la cavidad abdominal. Al girar el intestino delgado del ratón hacia la izquierda, se puede ver que la vena porta en el portal del hígado está formada por la confluencia de la vena esplénica y la vena mesentérica. Libere la vena cava infrahepática por encima de las venas renales de forma bilateral. Libere la superficie diafragmática sobre el hígado, presione el hígado hacia abajo y corte el ligamento falciforme de la vena cava superior e inferior del hígado. Inserte la aguja de infusión número 9 en la vena porta, fije la pinza arterial y gire la bomba de perfusión. Al mismo tiempo, se pinzan rápidamente las venas cava suprahepática e inferior, se corta la vena renal con antelación y se inicia todo el proceso de perfusión in situ.
Primero, utilice 200 ml de solución D-Hank que contenga glucosa 1,0 g/L y heparina 5000 UI/L, y caliéntelo a 39 °C en un baño de agua a un caudal de 20 ml/min. Intente eliminar los glóbulos rojos acumulados en el hígado. Luego use solución de perfusión enzimática, 0,05 mmol/lca2+, 0,05% colagenasa IV, 0,08% proteinasa e, 4,8 g/l.
Hepes (pH 7,4-7,6), 5 % FCS-Hi en D-Hank (100 ml), caudal de 5 ml/min, se utiliza para digerir el hígado. Después de 20 minutos, use tijeras esterilizadas para cortar el tejido del hígado, colóquelo en un plato de cultivo limpio e ingrese a la cámara celular para realizar las siguientes operaciones. Retire la cápsula hepática y la vaina de Gleason de la placa de Petri. Triture el hígado hasta obtener una pasta, póngalo en PBS que contenga 0,05 % de colagenasa IV, 0,001 % de dnasei y 5,3 % de FCS-HI (V/V) y agítelo en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos para digerir completamente el hígado. tejido. El tejido hepático digerido se examinó con un alambre de acero de malla 100 y el tejido hepático fallido se trituró con el núcleo de una aguja de una jeringa de vidrio y se lavó con medio de cultivo RPMI1640. Coloque el tejido hepático filtrado en un tubo de centrífuga Falcon de 50 ml, agregue medio de cultivo RPMI1640 a 50 ml y ajuste la temperatura a 20 °C 100x.
Centrifugar durante 5 minutos para eliminar la mayor parte de las células parenquimatosas hepáticas. Transferir el sobrenadante a otro tubo Falcon y centrifugar a 350 x g durante 65.438 ± 00 min. El sedimento se resuspendió 350 veces en 50 ml de medio RPMI1640.
Centrifugar durante 10 minutos. Resuspender el precipitado en 16 ml de PBS y añadir la capa superior de Percoll en un gradiente de dos partes. El gradiente de densidad de Percoll se divide en tres capas: de arriba a abajo 20% (densidad ~ 1,012
G/ml) 20 ml, 35 % (densidad ~ 1,014 g/ml) 15 ml, 50 % (densidad ~ 1,018 g/ml) 10 ml. 4℃900x después de la colocación.
Centrifugar durante 30 minutos. Sácalo suavemente sin agitar el nivel del líquido para que quede una zona turbia en el medio de la capa de Percoll al 20%. Inserte el número de pin. 16 por debajo del nivel del líquido, succione unos 10 ml aquí. Añadir medio RPMI1640 a 50 ml, 900x.
Centrifugar durante 10 minutos, resuspender el pellet en medio mixto RPMI 164199, añadir 10% suero fetal bovino, 10% suero de caballo y 10 ng/ml de VEGF. Se contó el rendimiento celular y se realizó una prueba de exclusión con azul tripano para determinar la viabilidad.
1,4
Cultivo celular
Después de contar las células resuspendidas, sembrar 1,5x 106/pocillo en una placa de 24 pocillos cubierta con colágeno S medio. Después de 10 minutos, vuelva a aspirar la suspensión celular en un pocillo nuevo.
Cambie el líquido por primera vez después de 3 días y luego cambie el líquido cada 2 o 3 días, según la situación. Si se requiere un análisis inmunohistoquímico, las células se pueden sembrar en una placa de 6 pocillos con un portaobjetos en su interior. Cuando la confluencia celular alcanza aproximadamente el 80% -90%, se puede pasar. Durante el pase se utiliza habitualmente tripsina al 0,1,25%.
Identificación de 1,5 células
Identificación de la pureza celular Después de 3 días, cuando las células tengan forma de huso, seleccione aleatoriamente 10 campos de visión de cada pocillo bajo un microscopio de alta potencia. y cuente al menos 200 en cada campo. La luz ultravioleta con una longitud de onda de 325 nm estimula la autofluorescencia de las células. La morfología celular se observó bajo microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión. Identificación de células madre hematopoyéticas primarias y pasajeras mediante inmunohistoquímica
Expresión de desmina y α-SMA.