¿Cuáles son los métodos para separar proteínas? ¿En qué propiedades o características de las proteínas se basan?

(1) Método de extracción en solución acuosa

La solución acuosa de sal diluida y sistema tampón tiene buena estabilidad y alta solubilidad para las proteínas. Es el disolvente más utilizado para la extracción de proteínas. La dosis habitual es el volumen de materias primas. Se requiere una agitación uniforme durante la extracción para facilitar la disolución de la proteína. La temperatura de extracción depende de las propiedades de los ingredientes activos. Las proteínas aumentan con el aumento de la temperatura. Por lo tanto, la temperatura alta favorece la disolución y acorta el tiempo de extracción, pero por otro lado, el aumento de la temperatura desnaturalizará e inactivará la proteína. Por lo tanto, según esta consideración, la temperatura baja (por debajo de 5). grados) se usa generalmente al extraer proteínas y enzimas. Para evitar el proceso de extracción de proteínas Para la degradación, se pueden agregar inhibidores de enzimas proteolíticas (como ácido diisopropil fluorofosfórico, ácido yodoacético, etc.).

El. Lo siguiente se centra en la selección del valor de pH y la concentración de sal de la solución de extracción.

1. Valor de pH

Las proteínas y las enzimas son electrolitos anfóteros con puntos isoeléctricos El valor de pH de la extracción. La solución debe seleccionarse dentro del rango de pH

en ambos lados del punto isoeléctrico. Al extraer con ácido diluido o álcali diluido, es necesario evitar cambios en los grupos disociables de la proteína causados ​​por ser demasiado. ácidas o demasiado alcalinas, lo que resulta en cambios irreversibles en la conformación de las proteínas. En términos generales, las proteínas básicas se extraen con una solución de extracción ácida, mientras que las proteínas ácidas utilizan soluciones de extracción alcalinas.

2. Concentración de sal

Las concentraciones diluidas pueden promover la solubilización de las proteínas, lo que se denomina disolución de la sal. Al mismo tiempo, las soluciones salinas diluidas se combinan parcialmente con la proteína y tienen la ventaja de proteger la proteína de la desnaturalización. Se agrega una cantidad de sales neutras como NaCl a la solución de extracción. Generalmente, la concentración es de 0,15 mol.L. La solución tampón a menudo utiliza una solución de sal isotónica de fosfato y ácido carbónico de 0,02 a 0,05 M. (2) Método de extracción con disolventes orgánicos

Algunas proteínas y enzimas que están más firmemente unidas a los lípidos o tienen más cadenas laterales no polares en la molécula son insolubles en agua, solución salina diluida, ácido diluido o diluida. Se pueden utilizar disolventes alcalinos y orgánicos como etanol, acetona y butanol. Tienen cierta hidrofilicidad y fuerte lipofilicidad, lo que los hace ideales para extraer lipoproteínas líquidas, pero el método de extracción con butanol es particularmente ventajoso. algunas proteínas y enzimas que están estrechamente combinadas con lípidos. En primer lugar, porque el butanol es altamente lipófilo, especialmente su capacidad para disolver fosfolípidos. En segundo lugar, el butanol tiene ambos. Es hidrófilo y no causará desnaturalización ni inactivación de enzimas dentro del rango de solubilidad (la temperatura es). 10%, 40 grados es 6,6%). Además, el método de extracción con butanol tiene una amplia gama de selección de pH y temperatura, y también es adecuado para animales, plantas y materiales microbianos.

2. Separación de proteínas y purificación

Existen muchos métodos para la separación y purificación de proteínas, que incluyen principalmente:

(1) Separación basada en diferentes métodos de solubilidad de proteínas

1. Salado de proteína

La sal neutra tiene un impacto significativo en la solubilidad de la proteína. Generalmente, a bajas concentraciones de sal, a medida que aumenta la concentración de sal, la solubilidad de la proteína aumenta. continúa aumentando, la solubilidad de la proteína disminuye en diversos grados y precipita uno tras otro. Este fenómeno se llama sal cuando se agrega una gran cantidad de sal a la solución de proteína, iones de sal de alta concentración (como SO4 de. sulfato de amonio) y NH4) tienen un fuerte poder de hidratación, que puede apoderarse de la capa de hidratación de las moléculas de proteínas y hacer que "pierdan agua", por lo que las micelas de proteínas se coagulan y precipitan durante la salazón, si el pH de la solución está en. El punto isoeléctrico de la proteína, el efecto será más efectivo. Dado que el tamaño de partícula y la hidrofilicidad de varias moléculas de proteína son diferentes, la concentración de sal requerida para la sal también es diferente, ajustando la concentración de sal neutra en la proteína mezclada. La solución puede precipitar varias proteínas en etapas.

Los factores que afectan la salinidad son: (1) Temperatura: a excepción de las proteínas sensibles a la temperatura que funcionan a bajas temperaturas (4 grados), generalmente se pueden realizar. a temperatura ambiente Generalmente, la solubilidad de las proteínas disminuye a bajas temperaturas, pero algunas proteínas (como la hemoglobina, la mioglobina, la albúmina) tienen menor solubilidad a temperaturas más altas (25 grados) que a 0 grados y es más probable que se salten. (2) Valor de pH: la mayoría de las proteínas se encuentran en el punto isoeléctrico en la sal concentrada. La solubilidad en la solución es la más baja (3) Concentración de proteínas: cuando la concentración de proteínas es alta, la proteína que se va a separar a menudo precipita junto con otras proteínas (. fenómeno de sedimentación). Por lo tanto, se debe agregar una cantidad igual de suero antes de salar. Diluir con solución salina fisiológica para mantener el contenido de proteína entre 2,5 y 3,0 %.

Las sales neutras comúnmente utilizadas para salar proteínas incluyen principalmente.

Sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de sodio, etc.

Entre ellos, el sulfato de amonio es el más utilizado. Tiene la ventaja de un coeficiente de temperatura pequeño y una gran solubilidad (solución saturada en). 25 grados es 4,1 M, es decir, 767 g/l; la solubilidad saturada a 0 grados es 3,9 M, es decir, 676 g/l). Dentro de este intervalo de solubilidad, se pueden salar además muchas proteínas y enzimas; El efecto de sal segmentada del sulfato de amonio también es mejor que Otras sales son buenas y no causan fácilmente la desnaturalización de las proteínas. El pH de la solución de sulfato de amonio suele estar entre 4,5 y 5,5. Cuando se sala con otros valores de pH, es necesario ajustarlo. con ácido sulfúrico o amoníaco.

Cuando se utiliza sal para proteínas Después de la precipitación y separación, es necesario eliminar la sal de la proteína. El método común es la diálisis, es decir, la solución de proteína se separa. bolsa (comúnmente se usa celofán), se dializa con un tampón, y el tampón se reemplaza constantemente. La diálisis lleva mucho tiempo, por lo que es mejor realizarla a baja temperatura. Además, también se puede utilizar gel de glucosa G-25 o. G-50 para eliminar la sal a través de la columna y el tiempo utilizado es relativamente corto.

2, método de precipitación del punto isoeléctrico

Cuando la proteína está en estado electrostático, la repulsión electrostática entre partículas es el más pequeño, por lo que la solubilidad también es la más pequeña. Los puntos isoeléctricos de varias proteínas son diferentes y el pH de la solución se puede ajustar para alcanzar un cierto nivel. El punto isoeléctrico de la proteína hace que precipite, pero. este método rara vez se usa solo y se puede combinar con el método de sal.

3. Método de precipitación con solvente orgánico a baja temperatura

Se puede usar con agua Disolventes orgánicos miscibles, metanol , etanol o acetona, pueden reducir la solubilidad de la mayoría de las proteínas y hacer que precipiten. Este método tiene una resolución más alta que la sal, pero la proteína está más desnaturalizada y debe realizarse a baja temperatura.

( 2) Métodos de separación basados ​​en diferencias en los tamaños moleculares de las proteínas

1. Diálisis y ultrafiltración

La diálisis utiliza una membrana semipermeable para separar proteínas con diferentes tamaños moleculares.

La ultrafiltración utiliza alta presión o fuerza centrífuga para forzar el agua y otras moléculas pequeñas de soluto a través de una membrana semipermeable, mientras que las proteínas permanecen en la membrana. Se pueden seleccionar membranas con diferentes tamaños de poro para interceptar proteínas de diferentes pesos moleculares.

2. Método de filtración en gel

También conocido como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de tamiz molecular, este es uno de los métodos más efectivos para separar mezclas de proteínas según el tamaño molecular, el relleno más utilizado en columnas, los materiales. son el gel de glucosa (Sephadex

ged) y el gel de agarosa (gel de agarosa

(3) Separación basada en las propiedades cargadas de las proteínas

Proteínas en diferentes. En entornos de pH, las propiedades cargadas y el número de cargas son diferentes, y se pueden separar.

1. Método de electroforesis

Varias proteínas tienen diferentes pesos moleculares y número de cargas bajo el mismo Condiciones de pH Se pueden separar debido a la diferente movilidad en el campo eléctrico. A lo que vale la pena prestar atención es a la electroforesis de enfoque isoeléctrico, que utiliza un electrolito anfótero como portador. Durante la electroforesis, el electrolito anfótero forma un gradiente de pH que aumenta gradualmente. Cuando las proteínas cargadas nadan en ella, se detienen cuando alcanzan la posición de pH de sus respectivos puntos isoeléctricos.

2. Cromatografía de intercambio iónico

Los intercambiadores iónicos incluyen intercambiadores catiónicos (como carboximetilcelulosa; CM-celulosa) e intercambiadores aniónicos (dietilaminoetilcelulosa; DEAE?FONT

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LANG="ZH-CN">Celulosa), cuando la solución de proteína separada fluye a través de la columna de cromatografía de intercambio iónico, la proteína con la carga opuesta al intercambiador de iones se adsorbe en el intercambio iónico. En el reactivo, la proteína adsorbida luego se eluye cambiando el pH o la fuerza iónica (consulte el capítulo sobre tecnología de cromatografía para obtener más detalles)

(4) Método de separación basado en la especificidad del ligando: cromatografía de afinidad.

Aflinity

La cromatografía es un método extremadamente eficaz para separar proteínas. A menudo requiere solo un paso para separar una determinada proteína que se va a purificar de una mezcla de proteínas muy compleja y de alta pureza. El método se basa en el hecho de que ciertas proteínas pueden unirse de manera específica y no valente a otra molécula llamada ligando. Su principio básico: Las proteínas son complejas en los tejidos o células.

Existen en forma de mezclas complejas y cada tipo de célula contiene miles de proteínas diferentes. Por lo tanto, la separación, purificación y caracterización de proteínas son importantes en bioquímica. Hasta el momento no existe un método único o ya preparado que pueda extraerlas. cualquier tipo de proteína de la mezcla compleja de proteínas, por lo que a menudo se usan varios métodos en combinación.

Disrupción celular

1. Trituración de tejido a alta velocidad: convierta el material en una fina Pegue, colóquelo en aproximadamente 1/3 del volumen del cilindro, cierre bien la tapa del cilindro, primero coloque el regulador de velocidad en la posición más lenta y encienda el interruptor. Luego, acelere gradualmente hasta la velocidad requerida. Este método es adecuado. para tejidos viscerales de animales, semillas carnosas de plantas, etc.

2. Homogeneización del homogeneizador de vidrio: primero coloque el tejido picado en el tubo y luego coloque la varilla de molienda en la varilla de molienda y muela hacia adelante y hacia atrás, y muévalo hacia arriba y hacia abajo para triturar las células. Este método tiene un mayor grado de trituración de células que un triturador de tejidos de alta velocidad y es adecuado para pequeñas cantidades y órganos y tejidos de animales.

3. Ultrasónico. Método de tratamiento: use una cierta potencia de ondas ultrasónicas para tratar la suspensión celular para hacer que las células se agiten y se rompan rápidamente. Este método es principalmente adecuado para materiales microbianos. Se utiliza E. coli para preparar varias enzimas. A menudo se utilizan mg de bacterias/ml en el proceso de 1 kg a una frecuencia de 10 kg durante 10 a 15 minutos. La desventaja de este método es que se generará una gran cantidad de calor durante el procesamiento y se deben tomar las medidas de enfriamiento correspondientes. Aquellos sensibles a las ondas ultrasónicas y los ácidos nucleicos deben usarse con precaución.

4. Congelación repetida Método de fusión: Congele las células por debajo de -20 grados y descongélelas a temperatura ambiente. Repita varias veces debido a la formación. de partículas de hielo en las células y el aumento en la concentración de sal del líquido celular restante, se producirá hinchazón y la estructura celular se romperá.

5. Método de tratamiento químico: algunas células animales, como las tumorales Las células bacterianas pueden destruirse mediante el uso de dodecilsulfato de sodio (SDS), desoxicolato de sodio y otras membranas celulares. Las paredes celulares bacterianas son más gruesas, por lo que se puede utilizar lisozima para un mejor tratamiento.

No importa qué método se utilice. Las células del tejido roto, las proteínas intracelulares o las hidrolasas de ácido nucleico se liberarán en la solución, lo que provocará que las macromoléculas se biodegraden, lo que resultará en una reducción en la calidad de las sustancias naturales. La adición de fluorofosfato de diisopropilo (DFP) puede inhibir o ralentizar la autolisis; puede inhibir la actividad de las enzimas proteolíticas que requieren un grupo tiol en el centro activo, y agregar fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) también puede eliminar la actividad proteolítica, pero no toda, también puede seleccionar el pH, la temperatura o la fuerza iónica para que estas condiciones sean adecuadas para la extracción de la sustancia objetivo.

Concentración, secado y conservación

1. Concentración de la muestra

Durante el proceso de preparación de macromoléculas biológicas, la muestra se convierte muy diluido debido a la purificación en columna. Para fines de conservación e identificación, a menudo es necesario concentrar métodos de concentración utilizados:

1, descompresión y calentamiento, evaporación y concentración.

Por. Al reducir la presión de la superficie del líquido, se reduce el punto de ebullición del líquido. Cuanto mayor es el grado de vacío de la descompresión, menor es el punto de ebullición del líquido y más rápido se evapora. Este método es adecuado para algunos pacientes que son intolerantes a la concentración. de macromoléculas biológicas calientes.

2. Evaporación y concentración por flujo de aire

El flujo de aire puede acelerar la evaporación del líquido, formando una fina capa de solución, con el flujo de aire constantemente pasando a través de la superficie; o coloque la solución de macromolécula biológica en una bolsa de diálisis y colóquela en una habitación fría, y use un ventilador para soplar el aire para que el solvente que pasa a través de la membrana no se evapore, logrando así el propósito de concentración. Este método tiene una velocidad de concentración lenta y no es adecuado para concentrar una gran cantidad de solución.

3. Método de congelación

Las macromoléculas biológicas se congelan en hielo a bajas temperaturas. no ingresa al hielo sino que permanece en la fase líquida. Durante la operación, el líquido a concentrar primero se enfría para convertirlo en un sólido y luego se funde lentamente. La diferencia entre los puntos de fusión del solvente y el soluto. se utiliza para eliminar la mayor parte del disolvente. Por ejemplo, cuando la solución salina de proteína y enzima se concentra mediante este método, no contiene proteína ni enzima. Los cristales de hielo puro flotan en la superficie del líquido, y las proteínas y enzimas se concentran. la solución inferior. Retire los cubitos de hielo superiores para obtener una solución concentrada de proteínas y enzimas.

4. Método de absorción

Las moléculas de la solución se recogen directamente a través del absorbente para concentrarlo. El absorbente utilizado no debe reaccionar químicamente con la solución, no adsorbe macromoléculas biológicas y es fácil de separar de la solución. Los absorbentes de uso común incluyen polietilenglicol, polivinilpirrolidona, sacarosa y gel, etc., cuando se usa polietilenglicol. absorbente, primero coloque la solución de macromolécula biológica en una bolsa de membrana semipermeable, cúbrala con polietilenglicol y colóquela a 4 grados

Cuando el disolvente se filtra de la bolsa, el polietilenglicol lo absorberá rápidamente. Después de saturar el polietilenglicol con agua, se debe reemplazar por uno nuevo hasta alcanzar el volumen requerido.

5. Método de ultrafiltración

La ultrafiltración es un método que utiliza una membrana especial para filtrar selectivamente varias moléculas de soluto en una solución cuando el líquido pasa a través de la membrana bajo una cierta presión (presión de nitrógeno o presión de bomba de vacío). ), el disolvente y las moléculas pequeñas, las macromoléculas se bloquean y retienen. Este es un nuevo método desarrollado en los últimos años. Es más adecuado para la concentración o desalinización de macromoléculas biológicas, especialmente proteínas y enzimas. Tiene un bajo costo y fácil operación. , condiciones suaves y se puede mantener mejor La actividad de las macromoléculas biológicas y la alta tasa de recuperación son las ventajas. La clave para aplicar el método de ultrafiltración radica en la selección de diferentes tipos y especificaciones de membranas, caudal de agua y valor de corte del peso molecular. (es decir, el valor mínimo del peso molecular de las moléculas que generalmente pueden ser retenidas por la membrana) y otros parámetros son todos diferentes y deben seleccionarse según las necesidades de trabajo. Además, la forma del dispositivo de ultrafiltración, la composición del soluto y la composición del soluto. Las propiedades, la concentración de la solución, etc. tienen un cierto impacto en el efecto de ultrafiltración Diaflo

Valor de corte del peso molecular de la membrana de ultrafiltración:

Nombre de la membrana Corte del peso molecular Diámetro promedio grande de los poros.

XM-300300,000140

5050,00030

PM-30 30,00022

UM-2020,00018

PM-1010,00015

UM-21 ,00012

UM05500 10

Utilice la membrana de ultrafiltración anterior para hacer un tubo de fibra hueca, junte muchos de estos tubos forman un haz y conectan ambos extremos del tubo con baja fuerza iónica. El tampón se conecta de manera que el tampón fluya continuamente en el tubo. Luego, el tubo de fibra se sumerge en la solución de proteína que se va a dializar cuando el tampón fluye. a través del tubo de fibra, las moléculas pequeñas pueden difundirse fácilmente a través de la membrana, mientras que las moléculas grandes no. Este es el método de diálisis por filtración de fibra. Dado que el área de diálisis aumenta, el tiempo de diálisis se acorta 10 veces.

2.

Secado Los productos preparados a partir de macromoléculas biológicas, para evitar que se deterioren, son fáciles de conservar y, a menudo, requieren secado. Los métodos más utilizados son la liofilización y el secado al vacío, que son adecuados para el secado. Conservando sustancias que no son resistentes a altas temperaturas y son fáciles de oxidar. Todo el dispositivo incluye un secador, un condensador y el principio de secado al vacío, y el factor de temperatura se agrega al mismo tiempo. La presión de vapor disminuye a medida que disminuye la temperatura, por lo que a bajas temperaturas y bajas presiones, el hielo puede sublimar fácilmente en gas. Durante la operación, el líquido a secar generalmente se congela por debajo del punto de congelación para que se convierta en sólido y luego. el disolvente se convierte en gas a baja temperatura y baja presión y se elimina. El producto seco de este método tiene las ventajas de estar suelto, tener buena solubilidad y mantener una estructura natural, y es adecuado para secar y conservar diversas macromoléculas biológicas.

3. Almacenamiento

La estabilidad de las macromoléculas biológicas está estrechamente relacionada con el método de almacenamiento. Los productos secos son generalmente relativamente estables y su actividad puede permanecer sin cambios durante días o incluso años en condiciones bajas. temperaturas Los requisitos de almacenamiento son simples. Simplemente coloque la muestra seca en un desecador (con desecante en el interior), séllelo y manténgalo en el refrigerador a 0-4 grados. Se deben tener en cuenta los siguientes puntos al almacenar líquidos. >

1. Muestra No puede estar demasiado diluida. Debe concentrarse a una cierta concentración antes de poder envasarse y almacenarse. Si la muestra está demasiado diluida, desnaturalizará fácilmente las macromoléculas biológicas.

2. Generalmente, es necesario agregar conservantes y estabilizadores. Los conservantes de uso común incluyen tolueno y ácido benzoico, cloroformo, timol, etc. Los estabilizadores de uso común para proteínas y enzimas incluyen pasta de sulfato de amonio, sacarosa, glicerina, etc. También se pueden agregar a las enzimas para mejorar su estabilidad. Además, las macromoléculas de ácido nucleico generalmente se almacenan en tampones estándar de cloruro de sodio o citrato de sodio.

3. Los requisitos de temperatura de almacenamiento son bajos y la mayoría se almacena en refrigeradores a alrededor de 0 grados. Algunos tienen requisitos más bajos, que dependen de diferentes sustancias.