¿Se debe agregar tetrametiletilendiamina al gel de acrilamida?

No.

La electroforesis en gel de poliacrilamida es un método de electroforesis que utiliza gel de poliacrilamida como medio de soporte. En este medio portador se puede realizar una separación en función del tamaño molecular y la carga molecular de las sustancias separadas.

El gel de poliacrilamida tiene las siguientes ventajas:

①El gel de poliacrilamida es un polímero hecho de acrilamida y N,N'metilen bisacrilamida. La red de gel es un polímero carbono-carbono con cadenas laterales de amida y pocos o ningún grupo lateral iónico, por lo que el efecto electroosmótico es pequeño y no es fácil interactuar con la muestra.

② Dado que el gel de poliacrilamida es una sustancia sintética, la relación de concentración de monómeros se puede ajustar antes de la polimerización para formar diferentes grados de estructuras reticuladas, y su porosidad puede variar dentro de un amplio rango. Según el tamaño de las moléculas del material a separar, se puede seleccionar la composición de gel apropiada para que tenga tanto una porosidad apropiada como buenas propiedades mecánicas.

En general, los geles que contienen entre un 7-<@?7,5% de acrilamida tienen propiedades mecánicas adecuadas para separar sustancias con pesos moleculares de hasta 1 millón. Para las siguientes proteínas, utilice geles que contengan entre un 15-30% de acrilamida. Para pesos moleculares especialmente grandes se dispone de acrilamida al 4%. El pegamento de poros grandes es frágil y el pegamento de poros pequeños es difícil de quitar del tubo. Por lo tanto, cuando aumenta la concentración de acrilamida, se puede reducir el gel de doble contenido. La acrilamida mejora las propiedades mecánicas de los geles.

③ La poliacrilamida es térmicamente estable dentro de un cierto rango de concentración. El gel es incoloro y transparente, fácil de observar y puede medirse directamente con un detector.

④ La acrilamida es un compuesto relativamente puro que puede refinarse para reducir la contaminación. Las materias primas para sintetizar gel de poliacrilamida son acrilamida y metilbisacrilamida. La acrilamida se llama monómero y la metilbisacrilamida se llama reticulante. En solución acuosa, los monómeros y los reticulantes forman geles mediante polimerización iniciada por radicales libres.

En el proceso de reacción de formación de gel de poliacrilamida se requiere un catalizador, que incluye un iniciador y un acelerador. El iniciador proporciona radicales libres iniciales durante el proceso de formación del gel. Mediante la transferencia de radicales libres, la acrilamida se convierte en radicales libres para iniciar la reacción de polimerización. El acelerador puede acelerar la velocidad de liberación de radicales libres del iniciador. La compatibilidad de los iniciadores y aceleradores comúnmente utilizados es la siguiente:

Compatibilidad del catalizador de polimerización

Iniciador

Acelerador

(NH4 )

(NH4)

Riboflavina

Nota: (NH4), persulfato de amonio: N,N,N,N' tetrametiletilendiamina: la reacción iniciada por β-; El persulfato de dimetilaminoalanina y amonio se llama polimerización química; la solución de reacción iniciada por la riboflavina debe irradiarse con luz intensa, lo que se llama fotopolimerización. La polimerización de poliacrilamida se ve afectada por los siguientes factores:

1. El oxígeno en la atmósfera puede apagar los radicales libres y terminar la reacción de polimerización. Por lo tanto, la solución de reacción debe aislarse del aire durante el proceso de polimerización.

2. Ciertos materiales, como el vidrio orgánico, inhibirán la polimerización.

3. Ciertos productos químicos, como las sales rojas de la sangre, pueden ralentizar la reacción.

4. La polimerización a alta temperatura es rápida, mientras que la polimerización a baja temperatura es lenta. Los puntos anteriores deben tenerse en cuenta al preparar geles. El tamaño de la malla, la resistencia mecánica y la transparencia del gel dependen en gran medida de la concentración y el grado de reticulación del gel. La cantidad total de gramos de monómeros y agentes reticulantes contenidos en cada 100 ml de solución de gel se denomina concentración de gel, a menudo expresada como T% de conectividad, generalmente expresada como C%, y se puede calcular mediante la siguiente fórmula:

Fórmula

a: Gramos de acrilamida; b: Gramos de metilen bisacrilamida; m: Volumen de tampón (ml) Electroforesis en gel de poliacrilamida cuando la concentración del gel es demasiado alta Instrumento, el gel es duro y quebradizo y fácil de romper; si la concentración del gel es demasiado baja, el gel es blando y difícil de operar.

Si el grado de reticulación es demasiado alto, el gel será opaco e inflexible; si el grado de reticulación es demasiado bajo, el gel quedará blando. El gel de poliacrilamida tiene una viscosidad más alta, lo que no impide que la convección reduzca la capacidad de difusión, y debido a que tiene una estructura de red tridimensional, la capacidad de las moléculas para pasar a través de la red dependerá de la porosidad del gel y del tamaño y forma de la red. Partículas de material separadas. Este es el efecto de tamizado molecular del gel.

Debido a este efecto de tamiz molecular, el gel aquí no es solo un portador puro. Por tanto, además de prestar atención a los principios básicos de la electroforesis, también hay que prestar atención a diversas propiedades relacionadas con el propio gel (tamaño y forma de la malla, etc.). El número de malla de gel apropiado se puede seleccionar mediante la siguiente fórmula.

Fórmula

En la fórmula: P es el diámetro promedio de la malla, C es la concentración del polímero, d es el diámetro molecular del polímero (si no es una molécula rizada , entonces debería ser 5A), K es una constante y el valor de K depende de la cantidad de hinchamiento del caucho. La configuración geométrica, si las cadenas de polímero están entrecruzadas en ángulos aproximadamente rectos, es de aproximadamente 1,5. Según esta fórmula, podemos calcular aproximadamente el diámetro de malla por la concentración de polímero C. Por ejemplo, siempre sabiendo que la concentración de polímero es 5. %, el promedio de la malla El diámetro debe ser:

Fórmula

Este cálculo es aproximado y está lejos de la situación real. Alguien midió que la concentración total (T) de la solución de acrilamida era del 20%. Tamaño de malla después de la polimerización en electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de seis proporciones diferentes de bisacrilamida.

Se encontró que el tamaño de los poros está relacionado con la concentración total. Cuanto mayor es la concentración total, menor es el tamaño de los poros y mayor es la resistencia mecánica. Cuando la concentración total permanece sin cambios, el tamaño de poro de la metilen bisacrilamida (Bis) es el más pequeño cuando la concentración de Bis es del 5%. Cuando es superior a este valor, el tamaño de poro del polímero se vuelve más grande y el tamaño de poro del gel es uno de. Los factores en la electroforesis en gel son parámetros importantes que a menudo determinan el efecto de separación de la electroforesis.

Después de la práctica continua, se obtuvieron los valores de experiencia que se muestran en la Tabla 3. En términos generales, se utilizan geles con concentraciones <@7,5% para la mayoría de las proteínas del cuerpo y los resultados de la electroforesis suelen ser satisfactorios. , por lo que el gel compuesto por esta concentración se denomina "gel estándar".

Para aquellos geles utilizados en estudios críticos, es mejor seleccionar la concentración de gel óptima realizando pruebas previas en una serie de pasos de concentración de gel del 10%.

Tabla 3 Porcentaje de concentración en gel de proteínas y ácidos nucleicos en diferentes rangos de peso molecular en electroforesis en gel

Sustancias

Rango de peso molecular

Concentración de gel aplicable (%)

Proteína

5×105

20-30 15-20 10-15 5-10 2-5

Ácidos nucleicos

10-20 5-10 2-3,6

La electroforesis en gel de poliacrilamida se puede dividir en dos categorías: continua y discontinua. El primero se refiere al tampón utilizado en todo el sistema de electroforesis, con el mismo valor de pH y número de malla de gel, mientras que el segundo se refiere a dos o más tampones utilizados en el sistema de electroforesis, con valor de pH y tamaño de poro. La electroforesis intermitente puede concentrar muestras diluidas en capas durante la electroforesis, mejorando así el poder de resolución.

Cuando una proteína se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida, su movilidad depende de factores como su carga neta y el tamaño y forma de la molécula. Si se añade un reactivo para eliminar el factor de carga, la movilidad electroforética depende del tamaño de la molécula y el peso molecular de la proteína se puede determinar mediante electroforesis. En 1967, otros descubrieron que el detergente aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS) tenía este efecto.

Cuando se añaden cantidades suficientes de SDS y mercaptoetanol a una solución de proteínas, el SDS puede reducir los enlaces disulfuro en las moléculas de proteínas. Debido a la carga negativa del dodecilsulfato, varios complejos proteína-SDS llevan la misma densidad de cargas negativas, que excede en gran medida la carga de las moléculas de proteína originales, enmascarando así las diferencias originales entre diferentes proteínas. La diferencia de carga también provocará cambios conformacionales después de que el SDS se una a la proteína.

El complejo proteína-SDS forma una varilla elíptica alargada que tiene aproximadamente forma de "cigarro". La longitud del eje corto de los complejos SDS de diferentes proteínas es diferente, que es de aproximadamente 18 A. Este complejo proteína-SDS está en el gel. La movilidad de la proteína ya no se ve afectada por la carga y la forma de la proteína original, sino que depende del tamaño del peso molecular, por lo que la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS se puede utilizar para determinar el peso molecular de la proteína.