3B Tumores malignos ginecológicos
En un rango más amplio de personas, la infección por citomegalovirus puede causar lesiones en órganos y tejidos de todo el cuerpo, provocando graves daños a fetos y bebés, e incluso la muerte. Puede estar relacionada con la incidencia de tumores malignos como este. como cáncer de cuello uterino. Por eso es muy importante saber que el CMV previene activamente la infección por citomegalovirus.
[Patología]
Patógenos
Los virus de la saliva pertenecen a la subfamilia Herpesvirinae y son un tipo de virus, el grupo de los herpesvirus humanos. , compuesto por ADN lineal bicatenario con un peso molecular de aproximadamente 150X106. El más grande es un icosaedro compuesto por 162 partículas de concha (partículas de concha de virus). Estructura típica del virus del herpes. Las formas del virus del herpes simple y del virus varicela-zoster son tan similares que es difícil diferenciarlos.
El CMV solo puede proliferar en fibroblastos humanos en cultivos de tejidos y no puede crecer en otras células animales, y la tasa de proliferación es muy lenta. El ciclo de replicación es de 36 a 48 horas, que es 8 horas más que el del herpes. Ciclo de replicación del virus. El aislamiento inicial de las células especiales llevó más de un mes, y las células se convirtieron en una extensión del parque, una célula gigante y un núcleo con un "halo" de núcleos que rodean grandes inclusiones eosinófilas. Las células diana de los organismos son las células epiteliales. Amplia reactividad cruzada entre varias cepas de citomegalovirus humanos. Acerca de
El CMV sobrevive en 20 éter hasta 2 horas. Si el valor de pH es inferior a 5, se puede inactivar colocándolo a 56 ℃ durante 30 minutos o mediante irradiación ultravioleta durante 5 minutos. La infección por citomegalovirus es resistente a la congelación y descongelación, o es inestable cuando se almacena a -20°C o -50°C. 10La lejía doméstica puede reducir significativamente la infección. Acerca de
La infección por CMV se caracteriza por las características inclusiones citoplasmáticas y nucleares de células gigantes, también conocidas como citomegalovirus. Los mastocitos en el tejido humano causan la enfermedad de inclusión de células gigantes.
El citomegalovirus es una infección importante en su patogénesis y existe indefinidamente en las células huésped en estado latente. Se sugiere que en la autopsia los pulmones, el hígado, el páncreas, las glándulas salivales, el sistema nervioso central y los intestinos también pueden ser diversos tejidos y órganos implicados en la latencia del virus. La gravedad de la infección congénita está relacionada con la falta de anticuerpos precipitantes y la capacidad de las células T para responder al citomegalovirus. La infección por citomegalovirus de sangre periférica suprime el fenotipo de linfocitos T citotóxicos activados en niños y adultos. Si la función de las células T del huésped se ve afectada, los virus latentes pueden resucitar y causar diversos síndromes. Estimulación de enfermedades crónicas causadas por la activación del citomegalovirus en el trasplante de tejidos. Algunos inmunosupresores potentes de células T, como la globulina antitimocítica, son responsables de la alta incidencia del síndrome clínico por CMV. Además, el CMV puede servir como cofactor funcional para activar la infección por VIH latente.
Pacientes infectados con enfermedades infecciosas agudas y sus focos de infección. El CMV se ha encontrado en la sangre, la saliva, las lágrimas, la orina, el semen, las heces, las secreciones cervicales y vaginales, la leche materna y otros citomegalovirus. La transmisión a través de la leche, la saliva y la orina puede durar desde semanas hasta años.
Grupos susceptibles
El citomegalovirus está muy extendido en todo el mundo y las personas tienen un amplio rango de susceptibilidad. Los humanos son el único huésped del citomegalovirus.
Encuesta serológica: Tendencias estacionales en la prevalencia de anticuerpos contra citomegalovirus en adultos de 40 a 100 años.
Diferentes países y diferentes condiciones económicas tienen diferentes tasas de infección. En Asia y África, donde el 90% de las personas están infectadas, la mayoría son más jóvenes y tienen anticuerpos e infección a una edad más temprana, mientras que en los países occidentales las infecciones ocurren en una etapa posterior. La encuesta también mostró que los grupos económicos y de bajos ingresos tienen tasas de infección más altas. Para este grupo de 70 años, la tasa de positividad de anticuerpos es mayor que la de los de 20 años. Las mujeres tienen más probabilidades de desarrollarlo en hombres de 20 a 30 años y en hombres de 50 a 60 años. Después de los 35 años, las tasas de positividad de anticuerpos entre hombres y mujeres son básicamente las mismas. Aunque el cuerpo ha producido anticuerpos circulantes, el virus se elimina de forma continua o intermitente, provocando una infección crónica o latente.
La mayoría de las personas se infectarán con CMV durante su vida, pero la infección es principalmente asintomática y latente. La infección por citomegalovirus en adultos está estrechamente relacionada con la función inmune. Los virus a menudo persisten durante toda la vida y existen como infecciones latentes. Sólo cuando el estado inmunológico del huésped está desequilibrado, como el trasplante de órganos y médula ósea, el cáncer, las matemáticas, el embarazo y la aplicación de inmunosupresores, el virus latente puede resucitar. La resurrección de virus latentes y de portadores asintomáticos puede provocar la propagación del virus. Como resultado del trasplante de órganos y los tratamientos inmunosupresores, los pacientes con VIH a menudo tienen una alta incidencia de virus y citomegalovirus latentes o inmunoactivados.
Vías de transmisión del citomegalovirus:
(1) Infección congénita: Embarazo (infección intrauterina), el citomegalovirus se puede transmitir al feto a través de la placenta.
(2) Infección adquirida (infección perinatal): Durante el parto, el virus de las secreciones cervicales puede transmitirse al recién nacido a través del canal del parto.
(3) El virus de la secreción de leche posparto se puede transmitir directamente a los bebés a través de la lactancia materna.
(4) El contacto prolongado, la desintoxicación, la saliva, la orina y las lágrimas pueden propagarse.
(5) La infección por CMV homóloga se puede transmitir mediante transfusión de sangre y trasplante de órganos. La infección por citomegalovirus homólogo es grave en las transfusiones de sangre y los trasplantes de órganos. Las transfusiones de sangre múltiples o las transfusiones de sangre masivas aumentan el riesgo de infecciones primarias y recurrentes. El riesgo de infección por citomegalovirus después de un trasplante de órganos o de médula ósea también es alto. Transmisión sexual
(6): Dado que el virus suele estar presente en las secreciones urogenitales, el semen o las secreciones cervicales pueden transmitirse directamente a través de las relaciones sexuales.
Debido a infección por semen, secreciones cervicales, lágrimas, heces (libido sexual oral, beso anal). Ruta de infección por citomegalovirus (centro) Tabla 1
Madre a feto, recién nacido, niño, adulto
Transmisión por contacto
(saliva, orina)
Transfusión de sangre
Hepatitis
Infección del tracto respiratorio Infección latente
Hepatitis
Infección del tracto respiratorio
gt
→Los niños con poca madurez aumentan de peso y los inmunosupresores provocan lentamente neumonía y
mucosa gastrointestinal
Hepatitis viremia
┌→No- invasivo
│BR/>;└→Infección→Glucosa en orina recién nacido sano mononucleosis infecciosa virus de la mononucleosis infecciosa
Enfermedad similar a la mononucleosis infecciosa→Policitemia viral en orina, función hepática anormal
Plaquetas transitorias/>Infección oculta con disminución de la transfusión de sangre
Fiebre inexplicable e infección asintomática
→enfermedad sistémica de inclusión de células gigantes
↓
, o signos de retraso mental.
[Journal of Immunology]
La infección por citomegalovirus puede causar una disminución de la función inmune, especialmente de la función inmune celular. La infección por CMV afecta significativamente las funciones de las células del timo y del bazo, los fagocitos mononucleares, las células NK y las células CTL.
En el laboratorio, se suprimió el timo y el bazo de cobayas recién nacidas con infección aguda por CMV, se redujo el número de timo y células T en ratones adultos y se detectó un 88% de citomegalovirus tímico.
La infección por citomegalovirus afecta la función del bazo y reduce la actividad proliferativa de los linfocitos esplénicos. ConA estimula los esplenocitos para que produzcan IL-2, que se reduce significativamente.
ltBr La inmunosupresión causada por la infección por citomegalovirus está relacionada con la replicación intracelular del virus. La replicación del CMV se caracteriza por fagocitos mononucleares y células infectadas por citomegalovirus en la respuesta inmune, muy probablemente con importantes funciones reguladoras de fagocitos mononucleares, células T, células B y ciertos linfocitos no identificados en monocitos y funciones efectoras. La infección por citomegalovirus altera la función inmune de muchos linfocitos. Acerca de
Mononucleosis aguda causada por infección por citomegalovirus. La respuesta de proliferación mitótica de los linfocitos de sangre periférica, el debilitamiento del antígeno del citomegalovirus y del antígeno del VHS, induce un aumento de los niveles de interferón y la relación CD4/CD8 cae a 1,7 ± 0,70,2 · 0,2, provocando una disminución de la actividad de las células T.
Para algunas enfermedades de larga duración, la proporción de subconjuntos de células T en la mayoría de los pacientes no ha vuelto completamente a la normalidad después de 10 meses.
La inmunosupresión causada por la infección por citomegalovirus es causada por el virus de la infección por monocitos grandes y la disfunción de las células CD8. Los fagocitos monocitos desempeñan un papel importante en la inmunidad anti-CMV. No solo pueden fagocitar directamente y prevenir el virus, sino que, lo que es más importante, pueden manejar la secreción, regulación y amplificación de las respuestas inmunes, los antígenos actuales y las citocinas. Durante la infección por CMV, la influencia de la función de los fagocitos mononucleares, la fagocitosis de los macrófagos causada por la infección por citomegalovirus reduce los radicales libres de oxígeno intracelular, los cambios en la expresión de los receptores FC y los receptores del complemento, los productos agrícolas de baja calidad con función presentadora de antígenos, la IL-1 también reduce Respuestas de IL-1 e IL-2. Moses et al. midieron la proliferación de timocitos y descubrieron que la actividad de IL-1 disminuyó y la producción de IL-1 disminuyó, lo que puede conducir a un desequilibrio de las células TH/TS.
Efecto antagonista de la propagación del citomegalovirus sobre las células NK. Las células NK participan activamente en todo el proceso de infección anticitomegalovirus. La actividad de NK es alta, pero no necesariamente hay una respuesta protectora, pero hay evidencia de infección activa. Las células NK no pueden prevenir la aparición de una infección primaria por citomegalovirus, pero una vez que se infectan, las primeras etapas de la infección por citomegalovirus limitarán la propagación, de modo que la infección sea limitada. Las células NK y las células CTL son células efectoras importantes contra el CMV. En las primeras etapas de la replicación del CMV, antes de que se produzcan viriones infecciosos, pueden cortar las células infectadas, lo que permite que el virus aborte y se propague de una célula a otra. En el modelo de ratón, el IFN potenció el efecto antiviral mediado por las células NK después de 3 a 5 días de acción viral. CTL citotóxicos en el bazo y las células de sangre periférica los días 6 a 21. La actividad de las células NK y CTL determina la sensibilidad a la infección por citomegalovirus y el cuerpo se recupera fácilmente después de la infección. Las actividades de las células infectadas por citomegalovirus, las células NK y las células CTL también se ven gravemente afectadas. Además, la inmunidad celular específica puede prevenir la recurrencia de la infección por CMV. Fue para detectar la aparición de respuestas de células T en receptores de trasplante de riñón infectados con citomegalovirus. Se encontró que 14 reacciones citotóxicas tuvieron 20 reacciones citotóxicas y 6 reacciones citotóxicas tuvieron consecuencias clínicas graves. Por tanto, la presencia de células T específicas puede prevenir la recurrencia de la infección por CMV.
La capacidad del organismo para reducir la virulencia de la infección por citomegalovirus puede deberse a diversos anticuerpos. Leche materna, secreciones cervicales, saliva, aunque anticuerpos específicos, incluidos los anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, todavía se pueden detectar anticuerpos contra el CMV, lo que no impide la propagación del virus. Los anticuerpos adquiridos pasivamente por el feto en el útero de la madre, de un canal de parto infectado o de la leche materna no se pueden detener. Los estudios han demostrado que la inyección intraperitoneal o intravenosa de 0,2 ml de globulina anti-CMV de alta potencia en ratones puede proteger completamente a los animales de la muerte antes de ataques fatales del CMV. CMV, etc. , y luego tuvo un segundo ataque, todos los animales todavía estaban vivos, lo que indica que los anticuerpos pueden reducir la toxicidad del citomegalovirus.
¿Qué pasará si las mujeres embarazadas se infectan con citomegalovirus?
Las mujeres embarazadas infectadas por citomegalovirus pueden infectar al feto a través de la placenta, provocando infección congénita, aborto espontáneo y muerte fetal.
Los bebés con infección congénita pueden ser asintomáticos, pero algunos casos graves pueden afectar múltiples órganos e incluso provocar la muerte. Los síntomas pueden manifestarse como hepatoesplenomegalia, ictericia, petequias o púrpura trombocitopénica idiopática, coriorretinitis y microcefalia. Todos los niños tendrán distintos grados de pérdida de audición, pérdida de visión, confusión, trastornos del movimiento, retraso mental, etc. La infección a través del canal del parto o la lactancia después del parto es una infección adquirida, con síntomas leves, mejor pronóstico, función hepática anormal e infección individual.
[Manifestaciones clínicas]
¿Cuáles son los síntomas de la infección por citomegalovirus?
La mayoría de los adultos sanos no presentan síntomas clínicos evidentes de infección por citomegalovirus. Algunos pacientes pueden desarrollar mononucleosis infecciosa, síntomas como fiebre, fatiga, dolor de garganta, linfadenopatía, dolor muscular, múltiples síntomas que incluyen neuritis, linfocitos atípicos en sangre periférica. y esplenomegalia.
La infección intrauterina durante el embarazo es propensa al aborto espontáneo y puede dañar la muerte fetal o el parto prematuro. Los síntomas neonatales incluyen hepatoesplenomegalia, ictericia, hepatitis, púrpura trombocitopénica, anemia hemolítica, degeneración del sistema nervioso, microcefalia, retraso mental, problemas de visión y audición.
La infección neonatal puede no presentar síntomas sistémicos, algunos pueden mostrar solo síntomas de insuficiencia respiratoria y otros pueden tener una función hepática anormal. No hubo daño a los nervios.
La historia natural de la infección por citomegalovirus es compleja. Una vez que la infección primaria desaparece, a menudo pasan semanas, meses o incluso años antes de que se desarrolle una infección subyacente. Infecciones recurrentes frecuentes, desintoxicación. Incluso si el virus latente se reactiva años después de la infección inicial, pueden surgir cepas virales antigénicamente diferentes tras la reinfección. Las manifestaciones clínicas de la infección por citomegalovirus están relacionadas con la función inmune del individuo y la edad. Como se muestra en la Tabla 2, los signos y síntomas de la infección nosocomial son diversos, ya sea por transmisión vertical, transmisión paralela o infección nosocomial.
Tabla 2 Evolución clínica y tipos de enfermedades infecciosas por CMV (Bayer Rocher)
Tipos graves: ictericia, anemia, hepatoesplenomegalia, trombocitopenia, infección neonatal (congénita)
Reducción de púrpura, invasión del sistema nervioso central, neumonía, miocarditis)
Tipo leve: animación suspendida, hipertrofia cardíaca, hiperbilirrubinemia.
2. Reinfección por CMV en el periodo asintomático posterior al nacimiento y la lactancia (¿congénita/adquirida?)
A. Sistémica
B. Hepatoesplenomegalia del sistema respiratorio tipo c (tipo tos ferina). p>. Tipo gastrointestinal
¿Tipo renal?
3. Adquisición
A. Influenza A
Tipos mononucleosis
Tipo respiratorio
d. Hepatitis gastrointestinal E
f. .
Verga. ¿Asintomático?
4.1, 2, 3 En cuanto a las consecuencias a largo plazo de la infección por citomegalovirus, la histiocitosis clínica después de la infusión de células mononucleares es común debido a disfunción inmune, retraso mental y bradicinesia.
Inflamación vascular, retiniana, neumonía e infecciones gastrointestinales. La mayoría de los pacientes con síndrome de Guillain-Pardin.
[Diagnóstico]
Si las manifestaciones clínicas de la infección por citomegalovirus no se pueden diagnosticar, es necesario confiar en referencias de laboratorio para aislar un virus a partir de muestras clínicas (o los anticuerpos específicos están elevados Más más de 4 veces o el título de anticuerpos continúa aumentando) para confirmar el diagnóstico.
Método de aislamiento de virus
La mejor saliva, orina, secreciones del tracto reproductivo, leche y glóbulos blancos se inoculan en fibroblastos humanos para su propagación y aislamiento. Los efectos citopáticos (visibles mediante fijación de células gigantes y tinción HE, CPE) aparecen al cabo de días o semanas. Las inclusiones nucleares, los halos perinucleares y las inclusiones citoplásmicas eosinófilas, muy parecidas a los "ojos de búho", también se pueden examinar mediante tinción con anticuerpos monoclonales o policlonales.
Los dos métodos más utilizados son las pruebas de anticuerpos del complemento en suero.
Test integral (CF), inmunofluorescencia indirecta (IIF), test inmunoenzimático (EIA), test de hemaglutinación indirecta (IHA) y radioinmunoensayo (RIA). Cuando se toma una sola muestra de suero para determinar el historial de infección por citomegalovirus, se deben recolectar muestras de suero inmediatamente y a intervalos de 2 semanas, 4 semanas y 8 semanas, y luego se deben recolectar muestras de suero combinadas con el aislamiento del virus, que pueden usarse para el diagnóstico de infección primaria.
Sondas de ADN
Las sondas marcadas con CMV 32P se han utilizado ampliamente y, para algunas muestras, la mezcla es un método más sensible que el aislamiento del virus, que se utiliza para la detección más sensible.
Reacción en cadena de la polimerasa
(1) Recogida y procesamiento de muestras
Recoja muestras, incluida la sangre, la orina y el tejido glandular del paciente. La capa leucocitaria preparada a partir de sangre entera se puede almacenar a -80°C. Las muestras de orina se pueden almacenar en nitrógeno líquido. Las muestras congeladas deben evitar la congelación y descongelación repetidas.
Centrifugar la muestra de orina a 2500 rpm durante 65438±00 minutos para eliminar los restos celulares y recoger el sobrenadante. La orina pretratada contiene inhibidores de la PCR como polietilenglicol (PEG 6000) según sea necesario: 50? l sobrenadante de orina y 50? 20 peg 6000 y 25 l? L-2 mol/L de NaCl, mezclar y colocar en un baño de hielo durante 6 horas; centrifugar a 15.000 rpm durante 30 minutos para recoger el precipitado.
Centrifugar a 6400 rpm durante 3 min; eliminar el sobrenadante por aspiración si es posible y suspender el sedimento en agua destilada. La suspensión se puede utilizar directamente para la amplificación por PCR. El producto de amplificación debe calentarse a 100 °C durante 10 minutos y enfriarse en un baño de hielo rápido.
(b) Plantilla de ADN preparada
1. Preparación de ADN molde a partir de muestras de sangre:
a: agregue NaCl para lograr que la concentración final de glucosa en suero sea de 1,50 mmol/l; 10 µl de suero se amplifican directamente por PCR a 70 °C durante 45 segundos.
Método B: Leucocitos preparados (BCP): (1) BCP, recoger el precipitado y lavarlo dos veces con PBS. ②¿Agregar 500? ? Homogeneizado de clorhidrato de guanidina 6mol/L. ③¿Agregar 30? ? 10 mmol/L EDTA, 10 mmol/L NaCl, 30? L20 Sarcosilo y 5? ,? Proteinasa K (10 mg/ml), mezclar y reaccionar a 60°C durante 1 h. ④¿Agregar 1130? lPrecipitación de etanol 65438±0 horas, -20℃. ⑤Centrifugar para recoger el ADN precipitado. ⑥ Lavar dos veces con etanol 70 y finalmente suspender el precipitado en Tris-HCl 10 mmol/L y EDTA 1 mmol/L. Reservar a 4°C.
2. Plantilla de ADN: ① Para la preparación de muestras de tejido congeladas: ① ¿El microtomo de congelación corta de 5 a 10? Coloque bloques de tejido congelados en tubos de plástico de 1,5 ml. (2) Agregue una solución de formalina al 10 % a la solución tampón preparada. ③Después de 10 minutos y de 1 a 2 minutos, vierta suavemente el sobrenadante, centrifugue, precipite con etanol y lave dos veces. ④ Secar a temperatura ambiente 10? 60 minutos ⑤ Agregue tampón de extracción (100 mmol/L de ácido Tris-clorhídrico, 4 mmol/L de EDTA, 8,0400 g/mL de proteinasa K) para triturar el sedimento recién sumergido (aproximadamente 50 a 100 L). El tejido fijado con formalina e incluido en parafina se desparafina y se seca; haga clic aquí. ⑥ Colocar en líquido a 37 ℃. ⑦Ponlo en agua hirviendo durante 7 minutos para inactivar la proteinasa K. ⑧Centrifugar para recoger el sobrenadante. Tomar de 1 a 10 litros para la amplificación por PCR.
3. Plantilla de preparación de muestra de orina ADN: ① 100? lEl sobrenadante de orina contiene 100? L 6 mol/L isotiocianato de guanidina, 7? L 2mol/L NaCl y 20? lSuspensión de polvo de vidrio (preparación de ADN, Asahi Glass Co., Ltd., Tokio, Japón). (2) Agitar a temperatura ambiente durante 65.438±00 minutos, centrifugar a 6.400 rpm durante 2 minutos y recoger el precipitado. ③ Lavar el precipitado una vez con etanol 50, Tris-HCl 10 mmol/L y NaCl 50 mmol/L pH 7,4 y centrifugar a 6400 r/min durante 1 minuto. ④ Lavar el mismo precipitado dos veces con agua y recoger el precipitado. ⑤Agregue agua destilada a 50?55 ℃ durante 65438 ± 05 minutos. ⑥Centrifugar a 15000 r/min durante 2 minutos, recoger el sobrenadante (que contiene ADN de citomegalovirus), realizar la amplificación por PCR, luego calentar la suspensión a 100 °C durante 10 minutos y enfriar rápidamente en un baño de hielo. Acerca de
(3) Cebadores y sondas
El diseño de cebadores y sondas se basa en la secuencia de los cuatro exones de la región promotora inmediata del gen de la proteína temprana del citomegalovirus y del antígeno tardío gp64. Gen y secuencia del gen de la proteína fosforilada pp71. La Tabla 3 enumera los cebadores y sondas comúnmente utilizados.
(4) Paso de amplificación por PCR
1,10× tampón de reacción: 100 mmol/L de ácido tris-clorhídrico, KCl con pH 8,4, 500 mmol/L, 25 mmol/L de cloruro de magnesio , 2 mg/ml de gelatina.
Taq ADN polimerasa: 5U/? Longitud
Concentración de 10×dNTP: la concentración de cada uno de los cuatro dNTP es de 2,0 mmol/L.
Primers: 100pmol/L
2.
¿Amplificación por PCR convencional
Mezcla de reacción con tampón de reacción 10X (50 litros)? Grande
¿10×dNTP? ?
¿5 moldes de ADN? ¿Elevar
Taq ADN polimerasa 0.2? ¿Litros (unidades SI)
0,5 por imprimación? Sube
Agua destilada 3,8? Aumentar
¿Agregar 1? Dos gotas de aceite mineral.
Calentar la mezcla de reacción a 94°C durante 5 minutos, luego 30 segundos a 95°C y 40 segundos a 55°C, y 60 segundos a 72°C durante 35 a 40 ciclos de amplificación.
Tabla 3 Cebadores y sondas para amplificación por PCR de CMV
Cebadores
Investigación
Secuencia (5'→3') Posición
Fragmento
Tamaño
IE1 CCACCCGTGTGCCAGCTCC
Gen temprano
159(BP)
IE2
CCCGCTCCTCCTGAGCACCC
IE3 (sonda)
ctggtgtcaccccgagtcccctgtacccgcgacttcc
LA1
CCGCAACCTGGTGCCCATGG
GP64 tarde 139
LA2 CGTTGGGTTGCGCAGCGGG
LA3 (sonda)
ttcttctgggacgccacacaccatctaccatcttcgccgg exón 1/>; p>
GGAATCCGCGTTCCAATGCA
IE1a
AGATCGCCTGGAGACGCCAT
Buenos días
/ IE2a
ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG
Exón 2 temprano
Setenta y dos
IE2b
CCGTGGCACCTTGGAGGAAG
IE3a
gtGTGACCAAGGCCACGACGTT
Exón de principios de marzo
167
IE3b
tctgccagaggacatctttctc
IE4a
ACAGATTAAGGTTCGAGTGC
Exón de principios de abril
179
IE4b
CAATACACTTCATCTCCTCG
IE4c
TTACCAAGAACTCAGCCTTC
Gen temprano exón 4
gt158
IE4d
gtgcgtgagccaccttgtctc
IE4e tataccccagacggaagaagaaaattca
Gen temprano exón 4
426
IE4f
ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG
PP1A
TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT gen ltBR/PP71
316
Pp1b
ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC
Pp71
3. Amplificación por PCR anidada: ① El mismo componente (2) está en la mezcla de reacción, solo los cebadores IE2a e IE4b (incluido el 721B de todos los exones 3), 100 pmol cada uno.
La amplificación se realizó durante 20 ciclos a 94°C durante 60 segundos, 150 segundos y 52°C y 72°C durante 480 segundos. ②¿Tomar 2? Para el producto de amplificación de L, se añadieron 100 pmol de IE3a e IE3b a cada cebador. Luego se realizaron 20 ciclos de amplificación a 94°C durante 60 segundos, 150 segundos y 52°C y 72°C durante 180 segundos.
(e) Identificación del producto
Los productos del análisis de amplificación pueden ser pruebas de hibridación en fase sólida y pruebas de hibridación en fase líquida (membranas).
1. Hibridación en fase sólida:
① La solución de prehibridación es 3×SSPE, 5×Denhardt, 0,5SDS y 25formamida. Los productos amplificados de la membrana se prehibridaron a 42°C durante 30 minutos. 60 minutos ② Agregue la sonda etiquetada (10 cpm/G, 2 ng/ml) y mezcle durante 30 a 60 minutos ③ Lave la membrana 3 veces con 0,2× sspe.01 SDS a temperatura ambiente, 5 minutos/tiempo, 60°C, 10 minutos /tiempo, y luego a temperatura ambiente Lavar más de una vez, 5 minutos/tiempo. ④Autorradiografía.
2. Hibridación en fase líquida y electroforesis en gel:
① Tome 1/10 del volumen del producto de amplificación y mézclelo entre 0,5 y 1,0 picomol en la sonda. ②Agregue cloruro de sodio, sodio, ácido fosfórico y glucosa a una solución de EDTA con una concentración final de 150 mmol/L, de modo que el volumen total sea 20? ? ③ 10 minutos a 95°C, luego 60 minutos a 56°C... ④ Centrifugar el tampón de muestra agregado durante 65, 438 00 segundos y ejecutarlo en un gel de poliacrilamida de 8 pulgadas. ⑤Después de la electroforesis, la tinción con bromuro de etidio y luego la autorradiografía con película de rayos X.
Aún no se ha encontrado la secuencia de bases de la molécula de ADN del HCMV. Aunque la longitud del fragmento de la endonucleasa de restricción de ADN es polimórfica, se desconoce su discreción en el genoma. Se determinó que el 90% de las cepas de citomegalovirus humano de tipo salvaje se pueden amplificar mediante PCR utilizando un solo par de cebadores utilizando más de dos conjuntos de cebadores con diferentes secuencias de HCMV, se pueden detectar casi todas las cepas. Entonces, en este caso, con la PCR, los cebadores se ubican en dos o más pares en diferentes regiones del genoma.
Durante el proceso de preparación del ADN molde del HCMV, a veces se producen algunos pequeños fragmentos de ADN y la reacción de PCR a menudo produce un cierto grado de producto final, lo que afecta los resultados de la medición. En este caso, se puede utilizar el método de PCR anidada. El principio básico es que la amplificación del ADN objetivo se divide en dos pasos: primero, se utilizan un par de cebadores para amplificar el ADN objetivo, incluidos fragmentos largos de ADN, y luego. los cebadores amplifican una pequeña cantidad de ADN objetivo. Realice una segunda amplificación. Al controlar el número de ciclos de amplificación en cada paso, se pueden prevenir los falsos positivos causados por pequeños fragmentos de ADN. Este enfoque también evita resultados falsos negativos.
La detección de muestras de HCMV mediante PCR es altamente sensible. Equivalente a docenas de moléculas de ADN viral o 1,5 PFU, se puede detectar la secuencia de ADN viral en el sobrenadante de un cultivo de tejido infectado por HCMV. El análisis de hibridación Southern de productos amplificados en muestras de orina detectó la secuencia de ADN de pghcvmv en el nivel 1; la hibridación de puntos solo fue detectable en el genoma viral de 4 × 104 células, que fue 2 mayor que la sonda de oligonucleótidos no radiactivos × 103. veces.
El valor de la aplicación clínica de la tecnología de PCR en la detección de la infección por HCMV se debe a que el ADN viral en los fluidos corporales se puede utilizar como un indicador temprano de la infección por HCMV cuando se presentan síntomas preclínicos o evidencia serológica de infección. La infección por HCMV se transmite a través de infecciones de la placenta y del canal del parto, y los recién nacidos infectados tienen una alta tasa de mortalidad. Por ello, también son muy importantes el diagnóstico temprano y el tratamiento oportuno mediante PCR, así como la atención prenatal y posnatal. Este enfoque también podría usarse para identificar la relación entre el HCMV y muchos donantes de trasplantes de órganos o tejidos gravemente enfermos. Además, la PCR puede detectar indicadores de estabilidad, pero también tiene análisis semicuantitativo, por lo que puede usarse como medio para evaluar diversas eficacias antivirales.
[Tratamiento]
Descubrir la infección primaria por citomegalovirus al principio del embarazo e interrumpir el embarazo lo antes posible. Si hay infección en el tercer trimestre del embarazo, se deben controlar más a fondo las malformaciones fetales y se deben tomar las medidas de tratamiento correspondientes. Terapia antiviral o síntomas clínicos de enfermedad congénita por citomegalovirus. Como la citarabina, las sulfonamidas, el interferón, etc., pero el efecto aún debe observarse más a fondo.
Acerca de
En el tratamiento de la infección por citomegalovirus, se pueden utilizar diversos preparados antivirales, como GCV, preparaciones de inmunoglobulinas anticitomegalovirus, interferones y factores de transferencia. Sin embargo, estos medicamentos no resuelven fundamentalmente el problema y tienden a rebotar después de suspender el medicamento. El virus latente de este virus puede ser una de las causas del SIDA, y académicos de varios países están comprometidos a controlar su infección. Los académicos estadounidenses desarrollaron recientemente dos vacunas vivas y los resultados fueron bastante buenos después del primer ensayo. Uno está elaborado a partir de la cepa del virus AD169 y el otro a partir de la cepa del virus Zhenzhen, los cuales han demostrado claramente su eficacia contra el citomegalovirus. Después de la administración parenteral, aumentan los anticuerpos contra el citomegalovirus, lo que mejora la función inmune del cuerpo.
[Prevención]
El citomegalovirus es muy dañino para los humanos y debe prevenirse activamente.
(1) Ejercita la conciencia sobre el estado físico. Mejorar la función inmune y la resistencia a las enfermedades, especialmente en las mujeres en edad fértil, para reducir el daño grave del citomegalovirus al feto.
(2) Necesitamos proteger a las pacientes que están embarazadas o que padecen enfermedades debilitantes crónicas o inmunocomprometidas y mantenerlas alejadas de fuentes de infección.
(3) Prestar atención a la higiene ambiental y a la higiene alimentaria.
(4) La lactancia materna no es adecuada si el citomegalovirus mamario es positivo.
(5)Prevención inmunológica. Aún bajo investigación y exploración.
Los síntomas clínicos, la edad, la condición física del paciente y la vía de infección varían mucho.
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Actualmente no existe un tratamiento eficaz para la infección por CMV.
Debido a la infección congénita por citomegalovirus y la carcinogénesis, algunos estudiosos creen que las vacunas pueden prevenir la infección por CMV. Debido a limitaciones técnicas, no se puede cultivar, es económico y práctico, y caro de morir. La aplicación efectiva de la vacuna CMV en la localidad se denomina vacuna viva atenuada.
Referencia:
¿Conoce al culpable de la infección latente por citomegalovirus? Acerca de
El citomegalovirus humano (CMV) es un virus de ADN de doble cadena y uno de los virus animales más grandes. Los humanos sólo están infectados con citomegalovirus humano. Relativamente débil, porque la virulencia de otros virus, el citomegalovirus humano, generalmente no invade órganos y tejidos humanos y causa daños graves, pero la integración de genes virales asociados con óvulos fertilizados puede prevenir o afectar la replicación y