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Progresos de la investigación en tecnología de diagnóstico rápido para pruebas de microbiología clínica
Palabras clave: Biología Molecular Fuente: Base de datos de texto completo de CHKD Journal "Contemporary Medicine", número 16, 2009
(Unidad del autor: Li Suli, Hospital 252 del Ejército Popular de Liberación)
En la actualidad, las enfermedades infecciosas siguen siendo un importante peligro oculto para la salud humana. Con la aparición de enfermedades infecciosas nuevas y repentinas, las enfermedades infecciosas que habían sido controladas están regresando y los tipos de microorganismos que causan enfermedades infecciosas se están volviendo cada vez más complejos. La amenaza de los microorganismos patógenos comunes no se ha eliminado, pero ha surgido una gran cantidad de cepas resistentes a los medicamentos y la aparición de nuevos microorganismos patógenos ha traído grandes problemas al diagnóstico y tratamiento clínicos. La dura realidad ha planteado mayores requisitos para la detección y diagnóstico de microorganismos patógenos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda a los laboratorios de microbiología clínica que se centren en el diagnóstico rápido tanto como sea posible. Utiliza todos los medios para convertir datos de laboratorio en información clínicamente útil.
1 Aplicación de la tecnología de identificación automática
Los exámenes de laboratorio de microbiología clínica se centran principalmente en la tinción, el cultivo y la identificación bioquímica, especialmente el aislamiento y el cultivo, que sigue siendo el método para detectar muchos patógenos del oro. estándar". Sin embargo, las bacterias necesitan cierto tiempo para crecer y reproducirse, por lo que es difícil acortar el ciclo de detección. Además, el cultivo de muchos patógenos se ve afectado por factores como los requisitos nutricionales, la aplicación de antibióticos y el contenido de patógenos. Los métodos manuales tradicionales son complejos de operar, tienen ciclos de detección largos y tienen una sensibilidad y especificidad limitadas. Para solucionar este problema, constantemente se desarrollan diversos sistemas automáticos de cultivo e identificación. Con el desarrollo y la aplicación de las computadoras, han surgido muchos sistemas automáticos y semiautomáticos de identificación bacteriana y susceptibilidad a medicamentos, denominados colectivamente "sistemas expertos de identificación microbiana". Estos sistemas han mejorado enormemente la eficiencia del trabajo y la precisión de la detección de los laboratorios clínicos. Los métodos de identificación tradicionales también se han mejorado gradualmente, acelerando la detección hasta cierto punto.
2 Métodos inmunológicos
La tecnología inmunológica utiliza reacciones antígeno-anticuerpo específicas para detectar microorganismos patógenos, lo que simplifica los pasos de identificación de microorganismos patógenos y ha atraído mucha atención. Los datos proporcionados por las principales bases de datos bibliográficas muestran que se han establecido casi todos los métodos de detección serológica de patógenos, lo que indica que este método se ha convertido en una tecnología de detección madura que se utiliza comúnmente en los laboratorios de microbiología.
2.1 Tecnología de aglutinación Las tecnologías de aglutinación comúnmente utilizadas incluyen la tecnología de aglutinación de látex y la tecnología de aglutinación de suero. Se utiliza para el diagnóstico preliminar, tipificación e identificación de microorganismos, como tipificación de Vibrio cholerae y Shigella, Escherichia coli O.57:H7, meningococos, etc. , y la identificación se puede completar en poco tiempo. Este método de diagnóstico es sencillo, rápido, preciso, específico y tiene una alta tasa positiva.
2.2 Tecnología de anticuerpos fluorescentes La tecnología de anticuerpos fluorescentes se basa en la alta especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. Utiliza la fluoresceína como marcador de antígeno para examinar complejos antígeno-anticuerpo específicos y sus ubicaciones bajo un microscopio de fluorescencia. Las principales características de la tecnología de anticuerpos fluorescentes son una gran especificidad y una alta velocidad. Lu Zhilin et al. informaron que los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia específica de la pared celular de Bacillus anthracis (CW-DFA) y antígeno capsular (CAP-DFA) producidos por colegas estadounidenses pueden identificar rápidamente Bacillus anthracis.
2.3 Inmunoensayo enzimático El inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) se ha utilizado ampliamente para la detección de una variedad de microorganismos patógenos y puede detectar antígenos patógenos en muestras y componentes de anticuerpos en el cuerpo. Se detectaron con éxito posibles Mycoplasma pneumoniae, virus de la influenza, virus de la parainfluenza, virus sincitial respiratorio y adenovirus a partir de una muestra de hisopo de garganta del paciente utilizando un anticuerpo monoclonal combinado con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de puntos en una membrana de nitrocelulosa. Gehring et al. identificaron E. coli O.57:H7 mediante ensayo de inmunoquimioluminiscencia ligado a enzimas (ELIMCL). Muchas enfermedades se han detectado con kits comerciales.
3 Tecnología de biología molecular
Con el rápido desarrollo de la tecnología de biología molecular, la comprensión de las personas sobre los microorganismos ha cambiado gradualmente de fenotipos externos a características estructurales genéticas internas, y la detección microbiana también ha pasado de Métodos bioquímicos e inmunológicos para la detección a nivel genético.
Para aquellos microorganismos que son difíciles o imposibles de cultivar, la información genética se puede obtener directamente, lo que abre nuevos campos para la detección microbiana y brinda nuevas oportunidades para el rápido desarrollo de la ciencia.
La tecnología 3.1 PCR tiene alta sensibilidad y fuerte especificidad. En la detección de patógenos, los métodos convencionales suelen ser difíciles de detectar con precisión microorganismos con morfología atípica y reacciones bioquímicas, incluso si aparece una gran cantidad de bacterias muertas sin la influencia de muestras mezcladas, puede detectar fácilmente microorganismos que contienen una gran cantidad. número de bacterias normales identificar patógenos en muestras utilizadas para identificar microorganismos de crecimiento lento o difíciles de cultivar, como Mycobacterium, Helicobacter pylori, Mycoplasma, Chlamydia, Spirogyra, etc. Actualmente, la tasa de detección positiva de otros métodos es muy baja y la tecnología de PCR es de gran importancia para la identificación de dichas cepas.
Sin embargo, la tecnología de PCR convencional tiene problemas como falsos positivos, formación de dímeros de cebador, operaciones de detección complejas y muchos vínculos de contaminación intermedia, lo que facilita la producción de resultados falsos positivos o falsos negativos. Para superar estas deficiencias, gradualmente se derivan y aplican en la práctica algunas nuevas tecnologías de PCR, como la PCR anidada, la PCR con transcripción inversa, la PCR múltiple, la PCR con cebador universal (UP-PCR), el análisis de polimorfismo de conformación monocatenario de PCR y el cebador aleatorio. Amplificación de polimorfismo de ADN (RAPD), análisis de polimorfismo de longitud de restricción (RFLP), PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real, etc.
3.2 Tecnología de detección basada en 16S rRNA y GyaB
3.2.1 Detección de 16S rRNA como gen diana El 16S rRNA existe en todas las células procarióticas. Son relativamente estables y tienen un alto número de copias, y sus secuencias contienen regiones variables y altamente conservadas, lo que permite el diseño de sondas específicas de grupo, género y especie. En la actualidad, se han secuenciado casi todos los genes de ARNr 16S de varias bacterias comunes. Estas características del gen codificante 16SrRNA lo convierten en una secuencia objetivo ideal para la clasificación de genes bacterianos y gradualmente se ha convertido en el "estándar de oro" para la identificación y clasificación de bacterias.
3.2.2 El uso del gen diana de la subunidad B de la girasa para detectar GyaB no solo tiene las ventajas del ARNr 16S, sino que también tiene una tasa de evolución genética más alta que los genes ribosómicos y está en forma de copia única en casi todos los casos. todas las bacterias existen. La investigación muestra que el mapa evolutivo basado en secuencias de GyaB es consistente con el mapa evolutivo basado en la hibridación ADN-ADN. Por lo tanto, el análisis de GyaB es particularmente adecuado para la diferenciación e identificación de cepas. Fukushima et al. diseñaron un chip genético dirigido al gen GyaB para detectar micobacterias. Los resultados experimentales muestran que el chip puede identificar micobacterias a nivel de especie y puede distinguir cepas estrechamente relacionadas, lo que tiene un valor de referencia importante para el tratamiento clínico. Muestra que el análisis de la secuencia del gen GyaB es una forma rápida y eficaz de identificar bacterias a nivel de especie. . método.
3.3 Tipificación de secuencias multilocus La tipificación de secuencias multilocus (MLST) es un método de análisis de biología molecular que se ha desarrollado rápidamente en los últimos años. Tiene alta resolución y es adecuado para epidemiología molecular y evolución molecular. MLST se utiliza cada vez más a nivel internacional como herramienta común para comparar cepas, establecer sistemas analíticos más precisos y estudiar el análisis epidemiológico de enfermedades y estructuras poblacionales causadas por diferentes cepas resistentes a los antibióticos, genotipos especiales relacionados y nuevas mutaciones.
3.4 Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una tecnología de amplificación de ácidos nucleicos sensible, específica, cómoda y rápida desarrollada en los últimos años. En comparación con los métodos tradicionales, la amplificación isotérmica no requiere ciclos térmicos y, dado que durante la reacción se produce una gran cantidad de precipitados de pirofosfato de magnesio blanco, el producto de amplificación no requiere electroforesis y puede juzgarse mediante observación visual o un turbidímetro. Por lo tanto, LAMP es un método de amplificación de ADN altamente específico y sensible que no requiere un termociclador y los resultados pueden juzgarse a simple vista. Este método diseña cuatro cebadores específicos para seis regiones del gen objetivo, utiliza polimerasa de desplazamiento de cadena para completar la reacción de amplificación del ácido nucleico a una temperatura constante (alrededor de 65 °C) durante aproximadamente 60 minutos y amplifica una banda característica en forma de escalera. El diseño de dos cebadores circulares puede aumentar la velocidad de reacción entre 1/2 y 1/3. La tecnología LAMP se puede utilizar para la detección rápida de microorganismos patógenos en el campo y se puede promover y aplicar en el campo y a nivel local durante tiempos de guerra.
4 Biosensores moleculares
Los biosensores moleculares son una nueva tecnología que combina la tecnología de sensores emergente con la tecnología de diagnóstico molecular. Es una nueva dirección para el desarrollo del diagnóstico clínico moderno.
Debido a las características de detección precisa y operación simple, los biosensores han logrado grandes avances en muchos campos en los últimos años y se han utilizado ampliamente en futuros diagnósticos de enfermedades infecciosas, detección de drogas, monitoreo de agentes de guerra biológica, etc. Entre ellos, los biosensores de ADN. Es el sensor de detección de patógenos más utilizado en la práctica clínica. El último biosensor fabricado por el científico chino Chen Jianzhu puede detectar la presencia de trazas de virus del SARS, virus de la viruela y ántrax en sólo 20 segundos, logrando así el propósito de un diagnóstico temprano.
Chip de 5 genes
El chip genético es un sistema de análisis de índice de calidad de paso alto. La tecnología de chips genéticos es una tecnología completamente nueva. Debido a que tiene la ventaja de examinar decenas de miles de genes a la vez, se considera el mayor invento en el estudio de la función genética. Utiliza muchos fragmentos de oligonucleótidos específicos o fragmentos de genes como sondas, que se organizan y fijan regularmente en medios sólidos como obleas de silicio, obleas de vidrio y membranas de nailon para formar una red de biomoléculas, logrando así la detección simultánea en una sola prueba. una variedad de enfermedades o muestras. Basados en las características de alto rendimiento, miniaturización y análisis paralelo, los chips genéticos están desempeñando un papel cada vez más importante en campos de investigación como la detección de patógenos microbianos, la identificación de especies, la detección de genes funcionales, la genotipificación, la detección de mutaciones y el monitoreo del genoma. En la actualidad se ha completado la secuenciación del genoma de diversos patógenos como bacterias y virus. Muchos genes especiales que representan varios microorganismos se convierten en un chip mediante la transcripción inversa, se puede detectar la expresión y el nivel de expresión de los genes patógenos en la muestra para determinar el patógeno del paciente, el proceso de infección y la respuesta del huésped, lo que mejora en gran medida la eficiencia de la detección.
6 Tecnología de huellas dactilares de proteínas
La tecnología de huellas dactilares de proteínas es una nueva tecnología que surgió con el auge de la proteómica. En los últimos años, cada vez más estudiosos se han dado cuenta de la necesidad de estudiar los microorganismos desde el nivel de las proteínas. Las proteínas son las ejecutoras de funciones bacterianas. Hay muchos tipos de bacterias y diferentes tipos de proteínas determinan sus funciones y propiedades en constante cambio. En 1996, Clayin et al. identificaron con éxito bacterias Gram negativas y Gram positivas mediante espectrometría de masas MALDITOF MS, mostrando que bacterias de diferentes géneros y especies tienen diferentes huellas dactilares de proteínas y las mismas bacterias tienen huellas dactilares de proteínas similares. Las bacterias se pueden identificar rápidamente basándose en sus huellas proteicas. Investigador Tang Hong del Instituto de Microbiología de la Academia de Ciencias de China y otros. La última tecnología de "huellas dactilares de calidad de proteínas" y sus métodos de detección se pueden utilizar para analizar cambios en la composición de proteínas en el suero de pacientes con SARS y sin SARS. Este método de detección del virus del SARS ha sido confirmado clínicamente por el Hospital Tiantan de Beijing. La tasa de positividad es cercana al 95% y la especificidad es cercana al 96%. Se pueden obtener resultados satisfactorios de la prueba el primer día que el paciente tiene fiebre. Algunos expertos dijeron que la tecnología de huellas dactilares de proteínas marca el nacimiento de un modelo de diagnóstico que hará época.
Con el desarrollo continuo de la tecnología informática, la detección de patógenos clínicos se desarrollará en dos direcciones: tecnología de detección altamente automatizada y simple y rápida. Mediante el uso de instrumentos automatizados, la tecnología de la biología molecular desempeñará un papel muy importante en el diagnóstico y la identificación de bacterias patógenas y la detección de genes resistentes a los medicamentos. Con el advenimiento de la era multidisciplinaria, el estado actual y los conceptos tradicionales de detección clínica de patógenos cambiarán por completo, logrando alta eficiencia, alta calidad y unificación rápida.