Métodos de transferencia de animales transgénicos
Dependiendo de los métodos y objetos de introducción de genes extraños, los métodos actuales para producir animales transgénicos incluyen principalmente microinyección, retrovirus, células madre embrionarias (células ES), pulso eléctrico, introducción de vectores de esperma, etc. Es el método más utilizado y tiene una alta tasa de éxito. Tomando como ejemplo la producción de ratones transgénicos, el proceso general es el siguiente.
1. Recolecte óvulos fertilizados
(1) Superovulación: seleccione ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad e inyecte 5 U de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y 2,5 a 5,0 U de coriónica humana. gonadotropina (HCG) para promover la ovulación y luego se inyecta hasta las 12 semanas de edad. Un signo de apareamiento exitoso es el descubrimiento de un supositorio vaginal blanco en la abertura vaginal de la rata hembra.
(2) Recupere los óvulos fertilizados: a la mañana siguiente de que los ratones machos entren en la jaula, utilice el método de dislocación cervical para diseccionar las hembras con tapones vaginales, retirar las trompas de Falopio y colocarlas en el cultivo. medio. Corte con cuidado la ampolla de la trompa de Falopio bajo un estereomicroscopio y enjuague suavemente los óvulos fertilizados con solución de hialuronidasa para separarlos de la trompa de Falopio y fluir hacia el medio de cultivo. Seleccione los huevos fertilizados con pronúcleos claros bajo un estereomicroscopio y transfiéralo a una placa de cultivo de embriones que contenga medio de cultivo. Luego agregue aceite mineral gota a gota en la placa de Petri para cubrir la superficie de la solución de cultivo y cultívelo en una incubadora de CO2 (37 °C, 5 % de CO2, 95 % de aire) durante aproximadamente 5 horas (generalmente los huevos fertilizados se toman alrededor de 10 am, y serán visibles cuando se cultiven l3 Pronúcleos femeninos y masculinos, la mayoría de los óvulos fertilizados generalmente forman pronúcleos, claramente visibles entre los 13 y los 18 años).
En segundo lugar, la solución de ADN se inyecta en el pronúcleo masculino del óvulo fecundado.
En un óvulo fecundado existen dos pronúcleos, uno del óvulo y otro del espermatozoide. Generalmente, el pronúcleo masculino del esperma es más grande y puede acomodar más ADN extraño, por lo que generalmente se inyecta una solución de ADN en el pronúcleo masculino. Además, la pureza del ADN genético a introducir debe determinarse mediante electroforesis en gel de agarosa. Coloque las gotas de cultivo y las gotas de ADN que contienen de 10 a 20 óvulos fertilizados en el portaobjetos de vidrio, luego fíjelas en la platina del microinyector, ajuste el centro del campo de visión a las gotas de ADN y use la mano derecha para usar un vaso. Pipetee con aceite mineral para absorber la solución de ADN. La cantidad de pipeteo se basa en la posición del menisco entre la solución de ADN y el aceite mineral. Luego mueva el centro del campo de visión hacia la gotita de óvulo fertilizado y controle la pipeta de óvulo. con tu mano izquierda. Fije el óvulo fertilizado con presión negativa, mueva la punta de la pipeta derecha hacia el óvulo fertilizado fijo, luego inserte el pronúcleo masculino del óvulo fertilizado e inyecte la solución de ADN en el pronúcleo masculino. Para confirmar si se ha producido la inyección, es necesario determinar visualmente si el pronúcleo masculino está agrandado. Sólo se recogieron huevos intactos, se cultivaron en una incubadora de CO2 a 37°C durante la noche y al día siguiente se seleccionaron los huevos que se desarrollaron hasta formar 2 células.
3. Trasplante óvulos fertilizados de 2 células en las trompas de Falopio de ratones hembra pseudopreñadas.
Cuando ratones macho vasectomizados se aparean con ratones hembra en celo (generalmente se utilizan ratones ICR), aunque no pueden provocar la fertilización, pueden estimular el canal cervical y activar el cuerpo lúteo de las hembras, creando la capacidad de continúa El medio endocrino del embarazo. Este tipo de ratón se llama ratón hembra pseudopreñada. Después de la microinyección, se trasplantaron óvulos fertilizados de dos células a las trompas de Falopio de ratones hembra pseudopreñadas al tercer día de apareamiento y aún podían desarrollarse normalmente. Lo mejor es trasplantar óvulos L2 en ambas trompas de Falopio durante la operación. De esta forma, cuando las condiciones son buenas, se pueden obtener 8 descendientes, pero a veces solo se puede producir 1 descendiente. Muchos óvulos fertilizados pueden dejar de desarrollarse a mitad de camino debido al daño causado por las inyecciones de ADN.
Cuatro. Identificación de genes introducidos
En general, entre todos los descendientes nacidos después de la transferencia de embriones, alrededor del 20% al 30% tienen genes introducidos. Por lo tanto, se requiere transferencia Southern o análisis por PCR de los genes introducidos para garantizar una selección exitosa. introducidos con genes extraños son criados y reproducidos.
El método de microinyección genética se caracteriza por una alta eficiencia de introducción e integración de genes exógenos. No requiere un vector para transferir directamente el gen objetivo, y la longitud del gen objetivo puede alcanzar los 100 kb (65.438). +100.000 pares de bases). Las líneas puras se pueden obtener directamente, por lo que el período experimental es corto.
Sin embargo, requiere instrumentos costosos y sofisticados, y la operación técnica es difícil. El sitio de integración y el número de copias integradas de genes extraños no se pueden controlar, y es fácil causar mutaciones de inserción en el genoma del animal huésped, provocando los cambios de rasgos correspondientes. e incluso la fatalidad.
Métodos de infección por retrovirus
Los retrovirus pueden invadir las células huésped e integrarse en el ADN cromosómico de las células. El ADN del gen exógeno se inserta en el vector retroviral y se empaqueta en partículas de virus altamente infecciosas a través de células auxiliares. Después de infectar a los embriones, las células embrionarias de mórula infectadas se introducen en el útero para convertirse en animales descendientes que portan el gen exógeno.
Este método tiene una alta tasa de integración, el gen objetivo no se destruye fácilmente y la mayoría de ellos son integración de un solo punto de copia única. Es adecuado para huevos de aves fertilizados donde el pronúcleo es difícil de observar. . Debido a la limitación del tamaño de la cápside del virus, el gen diana no puede exceder los 10 kb; de lo contrario, la actividad y la estabilidad se verán afectadas. Además, el ADN viral puede afectar la expresión de genes extraños en el animal huésped. Las células madre embrionarias (células ES) se refieren a células embrionarias indiferenciadas aisladas de la masa celular interna de la etapa de blastocisto. Tienen totipotencia de desarrollo y pueden cultivarse in vitro después de desarrollarse hasta una determinada etapa (1) del embrión. . Después del cultivo, la masa celular interna se despega, se dispersa y luego se cultiva. Finalmente, las células ES se aíslan, diseminan y caracterizan.
(2) A través de la tecnología de selección genética, se introducen genes exógenos en las células es mediante infección por retrovirus y métodos de pulso eléctrico, y las células que expresan genes exógenos se cultivan in vitro y se analizan.
(3) Obtener embriones de blastocisto como receptores de trasplantes de células ES.
(4) Las células madre embrionarias se inyectan en el blastocele mediante micromanipulación para acercarlas a la masa celular interna y formar quimeras.
(5) Después de la inyección del cultivo de embriones, los blastocistos sin defectos de desarrollo se examinan y se trasplantan al útero de la receptora pseudopreñada al tercer día de apareamiento para cultivar animales transgénicos. Este método tiene una alta tasa de integración de genes extraños y selecciona células es transformadas adecuadas antes de la implantación del blastocisto. Supera las deficiencias de seleccionar sólo entre la descendencia en el pasado y aprovecha al máximo varios métodos avanzados desarrollados en biología molecular. . Una tecnología prometedora. La desventaja es que no es fácil establecer líneas de células ES. Y debido al enfoque quimérico, el ciclo experimental es largo. En primer lugar, la investigación sobre biología del desarrollo
Los animales transgénicos se pueden utilizar para observar la expresión específica, la desactivación y los mecanismos reguladores de genes diana en diferentes etapas del desarrollo embrionario, y para comprender los efectos reguladores específicos de los tejidos. secuencias (como potenciadores y promotores) en la expresión sexual. Por ejemplo, la expresión específica del gen de la renina humana en ratones puede estar relacionada con la secuencia flanqueante 5' del gen. Además, los animales transgénicos también se pueden utilizar para identificar genes (incluidos genes endógenos) y sus actividades durante el desarrollo animal, y también pueden determinar las características de expresión de genes desconocidos relacionados con el desarrollo animal.
En segundo lugar, la investigación genética
Utilizando mutaciones naturales o genes modificados artificialmente como genes exógenos, se pueden construir animales transgénicos para estudiar los efectos fenotípicos de genes anormales inducidos por humanos, lo que puede ayudarnos comprender la estructura genética y el sistema de cobertura de funciones, que también se puede utilizar para análisis de impresión genómica, corrección de defectos genéticos, etc. En primer lugar, la investigación sobre enfermedades cardiovasculares
Los animales transgénicos pueden utilizarse para comprender diversos factores que regulan la función cardiovascular, como las lipoproteínas, el plasminógeno, etc., y establecer la relación entre la aterosclerosis y la hipertensión repentina y la oclusión venosa. y otros modelos animales transgénicos.
En segundo lugar, la investigación oncológica
El descubrimiento de genes tumorales es un gran avance en la investigación oncológica en los últimos 10 años. Se han descubierto más de 100 genes tumorales, incluidos genes del cáncer de mama. . Los experimentos han demostrado que varios vertebrados portan genes tumorales que, en circunstancias normales, no provocan cáncer de células, pero que pueden activarse en determinadas condiciones, provocando que las células cancerosas proliferen y provoquen cáncer. Al establecer animales transgénicos con genes tumorales, podemos aprender qué tejidos son sensibles a la actividad de transformación de los genes tumorales, la relación entre la formación de tumores y sus genes, el impacto de los genes tumorales en el crecimiento y la diferenciación, etc.
En tercer lugar, la investigación de enfermedades genéticas
Por lo general, se introducen genes exógenos con funciones normales en las células diana de los animales para compensar los genes defectuosos y cambiar el material genético de los enfermos. células y realizar tratamientos génicos. Por el contrario, al introducir artificialmente genes de enfermedades dominantes o uno o incluso múltiples genes exógenos en animales, se pueden preparar modelos animales transgénicos de enfermedades genéticas para el estudio y tratamiento de enfermedades genéticas humanas. Por ejemplo, Hungtington introdujo genes de corea en ratones y estableció un modelo animal de corea. Redhead introdujo el gen MBP (proteína básica de mielina) de ratones normales en ratones temblorosos y los síntomas de temblor de los ratones desaparecieron.
Cuatro. La investigación en inmunología de Babinet descubrió que, aunque los ratones transgénicos producían HBsAg, no hubo cambios patológicos dentro de los 6 meses, lo que muestra un estado persistente de portador del virus. Estos resultados indican que el daño a las células hepáticas en pacientes con hepatitis B no es causado directamente por la expresión del HBsAg del VHB, sino por la respuesta inmune a los antígenos virales en la membrana de las células hepáticas. Por lo tanto, este modelo de ratón transgénico se puede utilizar para estudiar la relación entre la tolerancia inmune y el daño de las células hepáticas y explorar su patogénesis. Además, los ratones transgénicos también proporcionan nuevos medios para estudiar las funciones de los antígenos principales de histocompatibilidad L y II. (1) Ratones transgénicos con receptores de poliovirus: clonar receptores de poliovirus humanos y producir ratones transgénicos. El gen PVR del poliovirus humano se microinyectó en embriones tempranos de ratón C57BL/10 para preparar y criar ratones transgénicos. El ratón expresó un receptor humano sensible al poliovirus. Además, los ratones infectados con este virus mostraron los mismos síntomas clínicos que los humanos, y la especificidad de la cepa del virus también mostró las mismas propiedades que los humanos. Por lo tanto, este ratón no es sólo un modelo de enfermedad humana, sino que también puede reemplazar a los monos para probar la eficacia y especificidad del poliovirus, que tiene una amplia gama de usos.
(2) Modelo de portador del virus de la hepatitis B: la incidencia de cáncer de hígado en los portadores del virus de la hepatitis B es de 100 a 200 veces mayor que la de las personas normales, pero no existe un tratamiento eficaz. El VHB sólo infecta a humanos o gorilas y no se han desarrollado otros modelos animales adecuados. En general, se cree que la respuesta inmune al VHB está dominada por genes y aquellos con una respuesta inmune insuficiente desarrollarán hepatitis crónica. El mecanismo del cáncer de hígado no es único. Existen varias mutaciones genéticas y cáncer entre la necrosis de las células hepáticas y la regeneración. hepatitis crónica. El genoma del VHB es una molécula de ADN circular de doble cadena con algunas regiones monocatenarias. Las longitudes de las dos moléculas de ADN monocatenario son diferentes. La cadena larga es la cadena negativa (3,2 kb) y la cadena corta es la cadena positiva, y representa aproximadamente del 50% al 80% de la cadena negativa. Por lo tanto, si el ADN de 1.2HB-BS se convierte en ADN lineal con extremos repetidos para la transducción, se puede lograr la expresión del genoma completo. Por otro lado, cuando sólo es necesario expresar el antígeno HBS, sólo es necesario introducir el gen 1.2HB-BS. Se introdujo ADN del VHB suplementado con 1,2 HB-BS en ratones C57BL/6J, el VHB se replicó en el hígado y se liberaron partículas del virus en la sangre. La expresión genética ocurre en la etapa embrionaria, pero muestra tolerancia inmune (estado pasivo) a estos antígenos virales y no muestra ningún cambio patológico, por lo que puede usarse como modelo para portadores humanos del VHB. Los ratones transfectados con genes humanos no mostraron manifestaciones clínicas anormales, al igual que los humanos.
(3) Modelo animal transgénico del antígeno de superficie de la hepatitis B: se pueden obtener ratones transgénicos introduciendo el gen del antígeno de superficie de la hepatitis B humana (HBsAg) en ratones, y el HBsAg se puede producir en los hígados de los ratones transgénicos. Este ratón genéticamente modificado no sólo simula el estado de portador del virus del paciente, sino que tampoco causa enfermedad. Chisari descubrió que los ratones transgénicos HBsAg positivos inmunizados con HBsAg más adyuvante completo o incompleto de Freund no lograron inducir anticuerpos específicos, mientras que los ratones transgénicos HBsAg negativos respondieron. Los ratones transgénicos HBsAg positivos no mostraron ningún cambio patológico dentro de los 6 meses, pero sí un estado tóxico persistente. Estos resultados experimentales indican que el daño de las células hepáticas en pacientes con hepatitis B no es causado directamente por la expresión de HBsAg, sino por la respuesta inmune a los antígenos virales en la membrana de las células hepáticas. Este modelo de ratón transgénico se puede usar para estudiar la relación entre la tolerancia a la respuesta inmune y el daño de las células hepáticas, y se puede usar para explorar la patogénesis de la patología y la terapéutica del VHB, el estado de portador persistente del virus y su eliminación, experimentos de detección de medicamentos, ADN del VHB La relación entre replicación, expresión y regulación en el huésped y la patogénesis de la hepatitis B y otras cuestiones relacionadas.
Además de los modelos animales de ratones transgénicos mencionados anteriormente, también se han establecido algunos otros modelos animales de enfermedades virales en ratones transgénicos. Por ejemplo, se pueden utilizar ratones transgénicos obtenidos inyectando el genoma del virus JC como modelos animales de leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), tirosina aminotransferasa (TAT) del virus L de linfocitos T humanos (HTLV-1). Se pueden utilizar ratones transgénicos preparados genéticamente. utilizados como modelos animales de enfermedades neurofibróticas humanas. El ADN de los mamíferos porta oncogenes, que se activan por factores físicos, químicos o biológicos, provocando una regulación anormal de la proliferación y diferenciación celular y un trastorno de su relación con los tejidos circundantes, lo que conduce al cáncer.
El uso de oncogenes o genes virales oncogénicos para crear modelos animales transgénicos de tumores puede explorar la relación entre oncogenes exógenos y protooncogenes en animales de experimentación, la expresión de oncogenes y la transformación del cáncer, y la expresión de oncogenes y los antecedentes genéticos del animal o los factores activadores externos.
Al insertar oncogenes o protooncogenes en óvulos de ratón fertilizados para cultivar ratones transgénicos, se puede estudiar el impacto de los oncogenes en la división y diferenciación celular normal a nivel general, estudiando así con precisión la relación formada entre los oncogenes y los tumores. . Por ejemplo, el gen del antígeno SV40T es un gen transformador que se ha estudiado ampliamente en ratones transgénicos. Brinster et al. (1984) introdujeron secuencias del antígeno T en ratones y descubrieron que genes exógenos podían expresarse preferentemente en el sistema nervioso central de los ratones y causar papilomas del plexo coroideo. Después de que las moléculas recombinantes unidas a la secuencia del antígeno T y diferentes secuencias promotoras se introducen en ratones, también pueden causar tumores en los tejidos donde se expresan las secuencias promotoras. Estos tejidos son el páncreas, el hígado, el cristalino e incluso el tejido del músculo cardíaco.
Además, tras conectarse a diferentes promotores, también se introdujeron en ratones oncogenes virales y protooncogenes celulares y se obtuvieron animales transgénicos. Por ejemplo, el oncogén C-myc se coloca bajo el control del promotor del gen del virus del tumor mamario de ratón (mMTV) para obtener ratones transgénicos. Estos ratones desarrollan tumores en el pecho, los testículos y el tejido linfoide. Estos resultados experimentales indican que la regulación anormal de los protooncogenes puede causar fácilmente el deterioro del tejido. Los resultados de la investigación antes mencionada del gen del antígeno SV40T y ratones transgénicos del gen c-myc respaldan firmemente la hipótesis de múltiples pasos de la tumorigénesis, es decir, la tumorigénesis requiere al menos dos transformaciones. Por ejemplo, el antígeno T y los genes C-myc se expresan en todos los órganos, pero sólo unos pocos órganos se vuelven cancerosos. (1) Modelo animal transgénico de la enfermedad de Gaucher La enfermedad de Gaucher es una enfermedad metabólica causada por una deficiencia de glicosidasa (un tipo de enzima lisosomal). Se puede dividir en tres tipos según los síntomas clínicos. Entre ellos, el tipo adulto (tipo 1) y el tipo juvenil subagudo (tipo ⅲ) tienen hepatoesplenomegalia, anemia y osteoporosis, y el tipo infantil agudo (tipo ⅱ) tiene síntomas del sistema nervioso central como espasmos. Las células de Gaueher (macrófagos que contienen glucocerebrósidos) se encuentran en varios tipos de hígado, bazo, ganglios linfáticos y médula ósea. Se han informado ratones desnudos espontáneos y modelos provocados experimentalmente, pero el tratamiento no se ha estudiado lo suficiente.
Se modificó el gen de la β-glucosidasa de ratón y se llevó a cabo la selección genética sobre esta base. Construya un nuevo gen de resistencia a la penicilina fosfotransferasa (neor) entre el exón 9 y el exón 10, o construya un vector de direccionamiento con HSV-tk en el extremo 3' y realice la selección PNS (método de selección positiva negativa). Posteriormente, los ratones quiméricos se cultivan y analizan en busca de homocigotos o heterocigotos. En comparación con la actividad de la β-glucosidasa de individuos normales, fue del 44% en heterocigotos y del 4% en homocigotos. Los homocigotos muestran acumulación de glucocerebrósido. Los homocigotos son de tamaño normal o significativamente más pequeños que los heterocigotos y presentan disnea y cianosis. Estos individuos no fueron criados por ratas hembra y todos murieron en 24 horas. La patología muestra acumulación de grasa en los lisosomas de macrófagos en el hígado, la médula ósea, el cerebro y el bazo, que es lo mismo que las lesiones humanas, excepto que la diferenciación de las células sanguíneas fetales tempranas se puede observar en el hígado de este ratón. Aunque la grasa se acumula en los lisosomas de los macrófagos, la muerte súbita es rara. Se cree que es consistente con los síntomas neurológicos agudos observados en niños con enfermedad de Gaucher tipo II.
Este modelo es uno de los modelos genéticos mejor evaluados y aplicados entre los modelos animales existentes de enfermedades transgénicas.
(2) Ratones transgénicos FAP
La amiloidosis familiar (FAP) es una enfermedad autosómica dominante que provoca el depósito de amiloide extracelular por todo el cuerpo. Enfermedades que dañan principalmente los nervios periféricos y autónomos. El componente principal de la proteína amiloide ha sido mutado. La mayoría de los pacientes han reemplazado la valina en la posición 30 por metionina. Se ha demostrado que la base genética correspondiente al aminoácido mutado ha sido reemplazada. Entonces, desde un punto de vista etiológico, es una enfermedad en la que las mutaciones de las proteínas conducen directamente al depósito de amiloide. Se construyó un gen amiloide mutante con el promotor MT del gen de la metalotioneína y se integró en ratones C57BL/6J mediante métodos transgénicos. El análisis de ratones genéticamente modificados mostró que la expresión del gen amiloide mutante puede observarse desde la etapa embrionaria, mientras que la deposición de amiloide mutante ocurre durante la adolescencia y posteriormente aumenta con la edad.
Sin embargo, el depósito de amiloide se produce en los nervios periféricos o autónomos de los humanos, pero no en los ratones transgénicos. No está claro si esto se debe a diferencias en las características histológicas entre ratones y humanos.
Por tanto, los ratones transgénicos no muestran síntomas clínicos.
A partir del análisis de estos ratones, se han aclarado los siguientes cuatro puntos: ① Los cambios en el complejo tetramérico compuesto de moléculas de transacetileno en la sangre son de gran importancia para la deposición de amiloide; El amiloide, es decir, el componente amiloide P sérico, no tiene ningún efecto sobre la aparición, expansión y distribución tisular de la deposición de amiloide. ③ El microambiente de cada tejido, es decir, la riqueza del flujo sanguíneo y la densidad del tejido, no tiene ningún efecto sobre la aparición. expansión y distribución tisular de amiloide. La deposición tiene una gran influencia; ④El entorno de alimentación de los ratones afecta la deposición de proteína amiloide. El problema clave con este ratón transgénico es que el depósito de amiloide no se produce en los nervios periféricos ni autónomos. Aclarar esta cuestión será importante para el desarrollo futuro de tratamientos.
Actualmente, la investigación sobre modelos animales de enfermedades transgénicas se limita mayoritariamente a la transferencia de un único gen. La expresión de funciones biológicas y la aparición de enfermedades suelen ser el resultado de la interacción entre genes. Por lo tanto, tiene más sentido utilizar tecnología transgénica para estudiar los genomas funcionales que causan enfermedades y síndromes de la MTC y crear modelos animales de genomas funcionales. Con la finalización del proyecto del genoma humano, se irá realizando gradualmente el desarrollo de modelos animales genómicos funcionales.