¿Cuál es la diferencia entre enzimas de restricción y endonucleasas?
Endonucleasa: Dentro de las nucleasas hidrolasas, es una enzima capaz de hidrolizar los enlaces fosfodiéster de la cadena molecular para generar oligonucleótidos, correspondientes a la exonucleasa.
Exonucleasa: La exonucleasa es una enzima que puede catalizar la hidrólisis de los enlaces 3,5-fosfodiéster y degradar secuencialmente los nucleótidos de un extremo de la cadena polinucleotídica.
Las endonucleasas de restricción se descubrieron por primera vez hace más de 30 años cuando se estudiaba el fenómeno de modificación de restricción específico del huésped de los bacteriófagos (virus bacterianos). Las bacterias pueden resistir la invasión de nuevos virus. Este método de "limitar" la supervivencia de los virus se puede atribuir a las enzimas de restricción dentro de las células que pueden destruir el ADN extraño. Las primeras endonucleasas de restricción descubiertas incluyeron EcoR I y EcoR II de E. coli, y Hind II y Hind III de Haemophilus influenzae. Estas enzimas cortan el ADN en sitios específicos, cortando los genes en pequeños fragmentos de genes.
Las endonucleasas de restricción se dividen principalmente en tres tipos: Las endonucleasas de restricción de tipo I son enzimas funcionales complejas con funciones tanto de restricción como de modificación, pero no tienen un sitio de corte fijo en la cadena de ADN, generalmente el sitio de escisión. de 1 kb se corta aleatoriamente en varios kb y no se producen fragmentos específicos. Las enzimas de tipo III son básicamente similares a las de tipo I. La diferencia es que las enzimas de tipo III tienen sitios de corte específicos. Sin embargo, estas dos enzimas tienen poca importancia para el análisis de restricción del ADN. Generalmente, las endonucleasas de restricción se refieren a enzimas de tipo II, que pueden reconocer y cortar secuencias de nucleótidos específicas en la cadena de ADN para producir fragmentos de ADN específicos.
Cuando la aplicación de enzimas de restricción se hizo popular en la década de 1970, muchas empresas representadas por NEB comenzaron a buscar más enzimas de restricción. Con excepción de algunos virus, las enzimas de restricción se encuentran sólo en procariotas. Se están buscando nuevas enzimas de restricción a partir de miles de bacterias y arqueas. El análisis de los datos secuenciados del genoma procariótico muestra que las enzimas de restricción son ubicuas en los procariotas y que todas las bacterias y arqueas de vida libre parecen ser capaces de codificar enzimas de restricción.
Las exonucleasas monocatenarias incluyen la exonucleasa ⅰ (exo ⅰ) de Escherichia coli y la exonucleasa ⅶ (EXO ⅶ). La exonucleasa ⅶ (EXO ⅶ) puede degradar el ADN en moléculas de ADN con un extremo 5' o un extremo 3' monocatenario, produciendo fragmentos cortos de oligonucleótidos. Es la única enzima activa que no requiere iones Mg2 y es una nucleasa muy tolerante. La exonucleasa VII (EXO VII) se puede utilizar para determinar la ubicación de ciertas secuencias espaciadoras especiales y secuencias codificantes en el ADN genómico. Solo corta moléculas de ADN con protuberancias monocatenarias en el extremo. En funcionamiento real, es necesario combinarlo con una helicasa.
Las exonucleasas de doble cadena incluyen la exonucleasa ⅲ de Escherichia coli (EXO ⅲ), la exonucleasa del fago lambda (λexo) y la exonucleasa del gen 6 del fago T7. La exonucleasa III (exoIII) de Escherichia coli tiene una variedad de funciones catalíticas y puede degradar varios tipos de enlaces fosfodiéster en moléculas de ADN de doble hebra. La principal actividad catalítica es catalizar la liberación de 5'-mononucleótido desde el extremo 3'-OH del ADN bicatenario en la dirección 3'→5'. La exonucleasa III (exoIII) es un ácido nucleico de Escherichia coli que genera regiones monocatenarias a partir de moléculas de ADN bicatenario a través de su actividad exonucleasa 3′→5′. El ADN modificado se puede utilizar en combinación con la enzima Klenow y se pueden añadir nucleótidos con isótopos radiactivos para preparar sondas radiactivas específicas.
La tecnología de análisis de endonucleasa de restricción es un método eficaz para la variación de patógenos, la identificación de cepas de virus, la tipificación, la comprensión de la estructura genética y la investigación epidemiológica. Es útil para la cuarentena animal, especialmente para distinguir animales y productos animales de entrada y salida. Es de gran importancia práctica determinar si el virus transportado es un virus vacunal o un virus salvaje, y si es un virus local o un virus extraño.