El método de verificación de los resultados de clasificación populares de artículos con puntuaciones altas puede resolver su problema de selección.
Principio de secuenciación de Sanger (Figura 1)[1]: La secuencia de ADN seleccionada se prepara mediante una reacción de secuenciación, en la que el desoxinucleósido trifosfato (dNTP) se combina con el didesoxinucleósido trifosfato terminado (ddNTP). Los nucleótidos al final de cada cadena están marcados con colores específicos de la base. La reacción de secuenciación produce fragmentos de varias longitudes que pueden separarse mediante electroforesis capilar o en gel, donde las bases marcadas revelan información de secuencia en cada posición. La longitud de lectura es de aproximadamente 700 pb.
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La PCR con transcripción inversa cuantitativa (RT-QPCR) es un método experimental para monitorizar cuantitativamente determinados ARN. En este método, el ARN total o ARN mensajero (ARNm) se transcribe primero en ADN complementario (ADNc) mediante la transcriptasa inversa. La reacción QCPR se realizó utilizando ADNc como plantilla y el producto de la reacción RT-qPCR se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa. RT-QCPR se ha utilizado en muchas aplicaciones de biología molecular, incluido el análisis de expresión genética, validación de interferencia de ARN, validación de microarrays, detección de patógenos, pruebas genéticas e investigación de enfermedades.
Resultados gráficos:?
El análisis de los resultados de WGS y WES mostró que se descubrió un nuevo gen de susceptibilidad PTGIS en la hipertensión pulmonar idiopática. c. 521 1G gt; A. ¿Para verificar la idoneidad para PTGIS? La transcripción genética se vio afectada y se detectó TGIS mutante mediante RT-qPCR. Este gen produce dos transcripciones diferentes, una banda corta y oscura (VAR-1) y una banda larga y brillante (VAR-2).
La secuenciación de Sanger del producto qPCR (Figura 3, derecha) reveló que VAR-1 es el intrón 4, que contiene 371 pb, lo que provoca la terminación prematura de la traducción y produce una disfunción de la proteína PTGIS. La secuenciación de VAR-2 mostró que se eliminó toda la región del exón 4, lo que resultó en la eliminación de un fragmento de 48 aminoácidos (p.Thr127_Arg174del).
En conjunto, ¿RT-QCPR y la secuenciación Sanger muestran PTGIS? c.521 1G gt; ¿un sitio de mutación causa PTGIS? Transcripción anormal de ARNm.
La transferencia Western (Western-Blot) se basa en el principio de que en la electroforesis en gel se pueden separar proteínas de diferentes pesos moleculares a diferentes velocidades de electroforesis. Transfiera la fase sólida a una membrana de PVDF o una membrana NC. Las proteínas o polipéptidos en fase sólida se utilizan como antígenos, reaccionan con los anticuerpos correspondientes y luego reaccionan con enzimas o anticuerpos secundarios marcados con isótopos. Los componentes proteicos expresados por genes diana específicos se separan mediante electroforesis y se utiliza el revelado del color del sustrato o la autorradiografía. detección. Este método se utiliza ampliamente en estudios de expresión del genoma a nivel de proteínas.
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El análisis de asociación WES revela un nuevo gen de susceptibilidad a la hipertensión arterial pulmonar idiopática (HAPI), BMP9. Consecuencias nocivas de las mutaciones, ¿elige BMP9? Se evaluaron las funciones de 6 mutaciones (S282fs es una mutación truncada y las otras 5 mutaciones son mutaciones sin sentido). Los resultados de Western-Blot mostraron que no había diferencias significativas en el nivel de expresión de la proteína pre-BMP9 entre las cinco mutaciones sin sentido y el tipo salvaje, pero el nivel de BMP9 maduro (25 KDA) fue significativamente menor que el del tipo salvaje (Figura 4a). . No se detectaron BMP9 pre-BMP9 ni BMP9 maduro con el mutante truncado S282fs (Fig. 4A yb). Esto indica que estas mutaciones tienen cierto impacto en la síntesis y ensamblaje de BMP9.
El sistema CRISPR-Cas es el sistema inmunológico natural de los procariotas. Después de ser invadidas por un virus, algunas bacterias pueden almacenar una pequeña porción de genes virales en su propio ADN en un espacio de almacenamiento llamado CRISPR. Cuando el virus vuelve a invadir, las bacterias pueden identificar el virus basándose en los fragmentos almacenados, cortar el ADN viral y silenciar la expresión de genes extraños.
Actualmente, el sistema CRISPR-Cas9 es el sistema más utilizado. El principio es que con la participación de GRNA y la proteína Cas9, el ADN genómico de la célula que se va a editar se tratará como ADN viral o extraño y se cortará con precisión. Se puede aplicar a métodos de edición básicos, como la eliminación y el reemplazo de genes, y también se puede utilizar para la activación de genes, la construcción de modelos de enfermedades e incluso la terapia génica.
Modelo de pez cebra
En la actualidad, el pez cebra se ha convertido en un nuevo organismo modelo reconocido. La proporción de genes homólogos humanos en el pez cebra llega a 87, y algunos genes relacionados con enfermedades se conservan con genes humanos de hasta 99. Esto significa que los resultados obtenidos de los experimentos con medicamentos en el pez cebra también son aplicables a los humanos en la mayoría de los casos. y a menudo se utilizan para verificar la función de enfermedades genéticas y mutaciones tumorales.
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Usando el análisis de datos WES, ¿se descubrió UBA1? Las personas con mutaciones somáticas (p.Met41) tienen fenotipos de síndromes inflamatorios. ¿UBA1? Hay dos isoformas debido a diferentes sitios de inicio de la transcripción, ¿UBA1a? y UBA1b. ¿Quieres estudiar UBA1? Para determinar la contribución de las isoformas a las enfermedades inflamatorias, establecimos un modelo de pez cebra editado con CRISPR-Cas9 como modelo in vivo para evaluar la función genética. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de control, la cantidad de neutrófilos en el pez cebra △uba1 y △uba1b era menor que en el pez cebra de tipo salvaje (Figura 5A y Figura 5B), lo que resultó en una regulación positiva de la expresión de genes inflamatorios en el pez cebra ( Figura 5, E). En resumen, ¿eliminar la UBA1 citoplasmática en el pez cebra? Los homólogos de isoformas pueden causar inflamación sistémica.
Modelo de ratón
Debido a que la homología genética entre ratones y humanos es tan alta como 78,5, el 93% de la secuencia genética en el genoma es la misma que la de los humanos, y la bioquímica Los indicadores y mecanismos reguladores son similares a los de los humanos. Los modelos de ratón se han convertido en un modelo importante para la investigación biomédica, como el estudio de funciones genéticas y mecanismos patogénicos, el establecimiento de modelos de enfermedades relacionadas con los humanos y la evaluación de la seguridad y eficacia de los medicamentos.
Resultados gráficos:
Este artículo, NOTCH3? ¿Vías de señalización que rodean los vasos sanguíneos y CD90 (THY1)? La diferenciación de fibroblastos desempeña un papel clave, que es necesario para el desarrollo de la artritis inflamatoria (AR). Para verificar el mecanismo de señalización de NOTCH3 en la AR, se establecieron un modelo de ratón (modelo de ratón Notch3?/? y un modelo de ratón con artritis inflamatoria (inducida por inyección intravenosa de suero mixto de ratón K/BxN), y se encontró que Notch3 Ratones ?/? El índice de artritis se redujo significativamente (p = 3,01 × 10 × 16) y la hinchazón de la pata se redujo significativamente (p = 5,02 × 10 × 14) (Fig. 6d, e). (anti-NRR3) redujo la gravedad de la artritis (p=3,47×10?8) y la inflamación de las articulaciones (p=5,54×10?9) (Fig. 6 f, g)
Este estudio avanza. La comprensión de la señal RA NOTCH proporciona la base molecular para el tratamiento dirigido de la AR mediante la regulación de la señal NOTCH3.
Según el propósito de la verificación, los métodos de verificación de los resultados de la secuenciación se pueden dividir en verificación de precisión y verificación funcional. Para detectar la precisión de las mutaciones, RT-QCPR se usa a menudo para detectar la expresión de la transcripción causada por mutaciones, y Western-Blot se puede usar para detectar el impacto de las mutaciones en la síntesis de proteínas. Además, la tecnología de edición de genes CRISPR-Cas9 se combina con. modelos animales para simular efectos de mutaciones. Los modelos más utilizados incluyen modelos de pez cebra y modelos de ratón. Puede elegir según sus necesidades y las ventajas y desventajas de cada método. , Wang Xiaohua. Desarrollo de tecnología de secuenciación de genes [J]. Journal of Bioinformatics, 2002. Genomics, 2009, 93(2):
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Asociación de variantes raras de PTGIS con susceptibilidad y respuesta vascular pulmonar en pacientes con hipertensión pulmonar idiopática [J]. JAMA Cardiología. 2020, 5(6): 677-684.
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