El siguiente es el proceso y los datos relacionados de la introducción del HBsAg, el gen que controla la síntesis de la proteína principal en la superficie del virus, en Pichia pastoris para producir la vacuna contra la hepatitis B.

(1) El plásmido en la figura contiene sitios de enzimas de restricción para SnaB, Avr, Bglⅱ y SacI, donde SacI está ubicado en el promotor y Bglⅱ está ubicado en el terminador. Si desea recombinar el gen HBsAg y el plásmido pPIC9K, el plásmido solo puede cortarse con las enzimas de restricción SnaB y AvrII, por lo que las secuencias de reconocimiento de SnaB y AvrII deben estar conectadas en las posiciones A y B en ambos lados del HBsAg. gene. Estas dos enzimas eliminan la pegajosidad producida.

(2) Después de obtener el gen objetivo, utilice ADN ligasa para conectar el gen objetivo al vector para formar un plásmido recombinante e introdúzcalo en E. coli para obtener una gran cantidad de plásmidos recombinantes.

(3) El tercer paso es obtener el gen que contiene el fragmento 5'AOX 1-3'AOX 1. Se debe seleccionar la endonucleasa de restricción Bgl para cortar el plásmido recombinante para obtener el ADN recombinante, y Luego introdúzcalo en la célula de Pichia pastoris.

(4) El gen 5′AOX 1-3′AOX 1 contiene un gen de resistencia a la kanamicina, por lo que la E. coli introducida en el plásmido recombinante puede resistir la kanamicina, por lo que para confirmar si Pichia pastoris es adecuada para Para que la transformación sea exitosa, es necesario agregar kanamicina al medio de cultivo para su detección. Mediante hibridación molecular del ADN se puede detectar si las células transformadas contienen el gen HBsAg.

(5) Pichia pastoris es una levadura metilotrófica que puede utilizar metanol como única fuente de carbono. El metanol puede inducir la expresión del gen AOX1. Por lo tanto, después de que la levadura transformada haya sido cultivada en el medio de cultivo durante un período de tiempo, se debe agregar metanol para mantener su vida e inducir la expresión del gen HBsAg.

(6) Las bacterias son procariotas y contienen únicamente ribosomas, mientras que las levaduras son eucariotas. Además de los ribosomas, también contiene retículo endoplásmico, aparato de Golgi y otros orgánulos. Por lo tanto, en comparación con las bacterias, la ventaja de utilizar células de Pichia pastoris como células receptoras para la ingeniería genética es que después de la síntesis de proteínas, las células pueden procesarlas (modificarlas) y secretarlas fuera de la célula para una fácil extracción.

(7) Las secuencias reconocidas por las endonucleasas de restricción son generalmente secuencias palindrómicas. Si el extremo pegajoso que se forma después de que la enzima de restricción corta la molécula de ADN es, entonces la secuencia de nucleótidos reconocida por la enzima es GACGTC.

Entonces la respuesta: (1) ¿SnaB? Avr evita la autocirculación de plásmidos y genes diana;

(2)¿ADN ligasa? Una gran cantidad de plásmidos recombinantes

(3)Bglⅱ

(4)Calinomicina

(5)Metanol

(6) Procesamiento (Modificado)

(7) Administración General de Aduanas de China