¿Qué es la contaminación celular?
1. Descripción general de los gusanos de caucho negros:
En cultivos celulares, a veces se ven pequeños puntos negros moviéndose bajo un microscopio de 400x, a veces en forma de puntos, a veces en forma de puntos. la forma de pequeño Tiene forma de lámina y se mueve en forma de vibración in situ (similar al movimiento browniano). Esta pequeña mancha negra no es ni una bacteria, ni un moho, ni un micoplasma (una vez le pedimos a Zhou Shouchang que utilizara un cultivo en placa de sangre y no aparecieron colonias). Actualmente, la gente en la industria lo llama "insecto del pegamento negro".
¿Es el insecto del pegamento negro una especie de criatura? Esto siempre ha sido un enigma en la industria. Los gusanos de goma negros generalmente existen en el suero, y el suero generalmente se filtra a través de una membrana filtrante de 0,1 μm, por lo que no hay bacterias, moho, micoplasmas ni otros microorganismos en el suero. Si el gusano de goma negro no fuera un ser vivo, seguiría aumentando, y cuando alcanzara un cierto número, competiría con las células por el crecimiento y los nutrientes del medio de cultivo, provocando que las células murieran por falta de nutrientes.
No importa cuáles sean los debates sobre los gusanos de la goma negra, hay algunos que actualmente son reconocidos por todos:
(1) Al competir con las células por el crecimiento, tiene un impacto negativo. sobre el crecimiento celular.
(2) Los "gusanos del pegamento" proliferarán durante mucho tiempo y una gran área dentro del campo de visión quedará cubierta por "gusanos del pegamento".
③ El "chinche del pegamento negro" está relacionado con el suero y tiene una gran relación con la calidad del suero.
2. Actualmente existen dos explicaciones para la conclusión del "gusano de pegamento negro":
Primero, el gusano de pegamento negro es un ser vivo. Es un organismo más pequeño que las bacterias, con un diámetro de menos de 0,1 μm, y se encuentra comúnmente en la mayoría de los sueros extraños, posiblemente protozoos contenidos en suero bovino extraño. Siempre que sea biológico, definitivamente tendrá un efecto sobre las células del medio de cultivo.
En segundo lugar, el insecto del pegamento negro no es un ser vivo. En el suero doméstico, los precipitados floculentos generalmente aparecerán después de la inactivación, pero cuando aparece el gusano de goma negro, el suero utilizado se ha congelado y descongelado repetidamente muchas veces. Por lo tanto, se especula que el llamado "chinche del pegamento negro" es en realidad una sustancia que contiene ciertos componentes proteicos en el suero, que pierde su actividad después de la inactivación. En el medio de cultivo, el movimiento que se observa al microscopio es en realidad el "movimiento browniano" de estas sustancias en la solución. A medida que las células consumen el medio de cultivo, estas sustancias se vuelven cada vez más abundantes. Finalmente, los nutrientes utilizados por las células se agotan y las células son propensas a morir.
3. Cómo lidiar con los "gusanos de goma negros":
En primer lugar, antes de comprar e inactivar el suero, hay que congelarlo y descongelarlo paso a paso, es decir. , a -20 ℃ -4 Después de que esté completamente derretido, colóquelo en un baño de agua y elévelo a 56 ° C junto con la temperatura ambiente para evitar cambios bruscos de temperatura e inactivar los nutrientes del suero.
La segunda es inactivar el sérum y luego almacenarlo por separado. Dispense el suero de acuerdo con la cantidad de suero utilizado cada vez y minimice el número de congelaciones y descongelaciones del suero. Preste atención a la esterilidad al reenvasar.
En tercer lugar, la concentración sérica es ligeramente mayor durante el cultivo celular. Por lo general, la concentración de suero en el cultivo celular es del 10% al 15%, pero si el suero se congela y descongela demasiadas veces, los nutrientes perderán actividad. De hecho, el 15% de los nutrientes no se pueden preparar en una concentración del 15%. entonces el medio de cultivo Generalmente, se utiliza 18% -20% de suero en la configuración.
Este tipo de insecto del pegamento negro se llama nanobacteria en el extranjero. Ahora voy a parafrasear parte de la información que vi de la siguiente manera, espero que te sea útil:
1 Descubrimiento de nanobacterias
Los científicos finlandeses Ciftcioglu y otros encontraron en un feto de ternero. células séricas Durante el proceso de cultivo se encontró una partícula con un diámetro de 50-500 nm. Esta partícula es altamente resistente a los rayos gamma; los experimentos de detección específicos para todos los microorganismos conocidos, incluido el micoplasma, son negativos; esta partícula no crece en medio de agar sangre ni en medio de micoplasma, y se utiliza métodos de tinción bacteriana comunes que también son difíciles de desarrollar. Por ello, Kajande identificó este como un nuevo microorganismo y lo denominó Nanobacterium sanguineum por su pequeño tamaño y características de vivir en la sangre. Y la cepa está depositada en la Deutsche Gesellschaft für Microorganisms (DSM no: 5819-5821, Deutsche Gesellschaft für Microorganisms, Braunschweig, Alemania).
2 Características biológicas de las nanobacterias
2.1 Nanobacterias: el cultivo de células bacterianas de mamíferos más pequeño El suero utilizado para el cultivo generalmente se esteriliza mediante filtración, y la esterilización mediante filtración generalmente se realiza con un diámetro de Filtro de 0,1 micras. La investigación de Kajander encontró 0,1 μ m.
La filtración por membrana no puede eliminar eficazmente las nanobacterias del suero, pero filtrar el suero con un filtro de 0,05 micrones puede eliminar eficazmente la contaminación por nanobacterias.
Aproximadamente el 3% de las nanobacterias en el cultivo celular pueden pasar a través de la membrana del filtro de 0,2 micrones, mientras que bajo filtración a presión, aproximadamente el 50% de las nanobacterias pueden pasar a través del filtro de 0,2 micrones. Las nanobacterias recién filtradas no fueron visibles bajo un microscopio de contraste de fase, pero pudieron observarse bajo un microscopio de contraste de fase después de cultivar durante 24 h en medio de cultivo celular sin aditivos séricos. Las observaciones de microscopía electrónica mostraron que el diámetro promedio de las nanobacterias era de 200 nanómetros, mientras que el diámetro mínimo de las nanobacterias de la progenie era de sólo 50 nanómetros. Sólo las células con un diámetro no inferior a 140 nm pueden mantener su metabolismo más básico. Kajande cree que en condiciones atmosféricas primitivas, las nanobacterias pueden haber sido la forma de vida más primitiva en los primeros días de la formación de la Tierra, por lo que es imposible medir esta antigua forma de vida desde la perspectiva de medir las formas de vida que han evolucionado durante miles de millones de años. Se especula que después de ser atacadas por factores indeseables, las nanobacterias pueden formar muchos fragmentos diminutos y liberarlos al medio ambiente. Cada segmento puede contener cierta información genética. Bajo ciertas condiciones, estas partículas "elementales" se unen para formar una comunidad. Se pueden formar nuevas nanobacterias cuando un número suficiente de partículas "elementales" proporcionan información genética completa.
2.2 Ciclo de proliferación lenta de las nanobacterias
Los microbiólogos suelen comprender las características de los microorganismos a través del cultivo. Sin embargo, no todos los microorganismos pueden cultivarse en el laboratorio, principalmente porque no comprendemos las condiciones de cultivo de estos microorganismos, el entorno en el que viven y si están relacionados con otros microorganismos. Las nanobacterias son microorganismos que tienen requisitos muy estrictos sobre el entorno de crecimiento. Su tasa metabólica es extremadamente lenta, sólo 65.438+0/65.438+00.000 de bacterias comunes. Se descubrió que las nanobacterias utilizan principalmente aminoácidos del medio ambiente en lugar de glucosa para proporcionar energía. Pueden utilizar glutamina, asparagina y arginina. A 37°C, hay 50-65,438+00 ml/L de dióxido de carbono y 900-950 ml/L de dióxido de carbono. Además, en un medio de cultivo celular que contiene 100 ml/l de suero fetal bovino y una cantidad adecuada de glutamina con un valor de pH de 7,4, las nanobacterias pueden crecer lentamente, con un tiempo medio de duplicación de 3 días, mientras que en un medio de cultivo celular sin suero , su tasa de proliferación es lenta y el tiempo de duplicación bacteriana se puede extender a 5-6 días bajo las condiciones de agregar una cantidad apropiada de BGF (un ultrafiltrado de sobrenadante de cultivo de Bacillus) o N3 (un ultrafiltrado de sobrenadante de cultivo de nanobacterias). En esta condición, su tasa de proliferación se acelera y el tiempo de duplicación se puede acortar a 0,6-65438±0d. En presencia de BGF, las nanobacterias pueden incluso crecer en medios de cultivo sólidos y formar colonias con un diámetro de 1 mm.
2.3 El fenómeno de biomineralización único de las nanobacterias
Transfiera las nanobacterias cultivadas en un medio que contiene suero a un medio sin suero y continúe cultivando (DMEM o RPMI-1640 se pueden observar nanobacterias dentro de 1 bacteria). Fenómeno de adhesión, se puede formar una biopelícula con un espesor de varias micras alrededor de las nanobacterias en 1 semana. Está firmemente adherido al fondo de la botella de cultivo y las nanobacterias viven en él (lo que obviamente es diferente de las nanobacterias cultivadas en un medio que contiene suero). En este punto, su tamaño es cercano al de una célula de levadura. Después de 2-3 semanas, debido al engrosamiento de la biopelícula, su diámetro se acerca al de los glóbulos rojos. El análisis de la composición química de esta biopelícula mediante el método EDX mostró que los picos de calcio y fósforo eran muy similares a los de hidroxiapatita. La observación por microscopía electrónica y el análisis espectroscópico infrarrojo por transformada de Fourier mostraron que su componente principal es la hidroxiapatita carbonatada, y las nanobacterias rodeadas por hidroxiapatita se pueden ver independientemente de si se usa suero como aditivo. Esto se puede ver incluso al dividir las nanobacterias. Las nanobacterias no producen uroquinasa ni fosfatasa alcalina. Incluso después de varias semanas de cultivo, el valor del pH de su medio de cultivo no cambia significativamente y permanece estable en aproximadamente 7,4. Esto demuestra que la hidroxiapatita generada en la superficie de la membrana celular de las nanobacterias es cristalina. derivado de macromoléculas biológicas, es decir, biomineralización. No es un fenómeno de cristalización física causado por un simple cambio en el valor del pH. Las nanobacterias utilizan calcio y fósforo en el sistema de cultivo para sintetizar hidroxiapatita como componente principal de su biopelícula. Este proceso de biomineralización está regulado por ciertos factores en el entorno de crecimiento, lo que hace que muestre diferentes apariencias, como hidroxiapatita, biopelícula bacteriana, arena, piedra, tumor, etc. (¡Esto puede ser parte de la razón por la cual algunos investigadores nacionales piensan que se trata de algunas sustancias inorgánicas de fosfato!).
En el medio de cultivo que contenía suero fresco, la biomineralización de las nanobacterias fue leve, debido a la presencia de fuertes inhibidores de la síntesis de hidroxiapatita, osteocalcina y fetuina en el suero. Debido a la presencia de estos inhibidores, la biomineralización de las nanobacterias se inhibió significativamente en presencia de suero. Cuando la concentración sérica disminuye, se potencia la biomineralización de las nanobacterias, que es fuerte y rápida en los sistemas de cultivo sin suero. Aunque el medio sólido Reifler modificado contiene un componente sérico de 750 ml/l, el componente proteico sérico se destruye durante el proceso de esterilización, por lo que no se inhibe la mineralización de nanobacterias en este medio. El diámetro de las colonias de nanobacterias cultivadas en este medio puede alcanzar de 1 a 5 mm. Además, la presencia de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) inhibirá significativamente los fenómenos biológicos de las nanobacterias. Debido al efecto protector de la biopelícula mineralizada y a la tasa metabólica extremadamente lenta, las nanobacterias pueden tolerar diversas condiciones físicas adversas, factores de daño químico y diversos antibióticos.
2.4 Métodos de detección de nanobacterias Dado que las nanobacterias no pueden crecer en medios de cultivo microbianos estándar, ni siquiera en el entorno de cultivo celular más adecuado, el crecimiento de las nanobacterias es extremadamente lento y su tasa metabólica es sólo normal de uno en 10.000. bacterias, lo que hace imposible que muchos métodos microbiológicos basados en la detección del metabolismo bacteriano puedan detectar la presencia de nanobacterias. Dado que las nanobacterias son difíciles de fijar utilizando métodos tradicionales de llama y etanol, y la mayoría de los tintes no pueden penetrar la pared celular y no pueden observarse con microscopios comunes, los métodos de tinción bacteriológica convencionales no pueden detectar la presencia de nanobacterias. A través de la investigación de Kajander et al., se descubrió que hornear en seco a 70°C durante 10 minutos puede solucionarlo eficazmente. Además, las nanobacterias se pueden teñir con colorantes rojo alizarina S, rojo Congo y nitrato de plata. Bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 400x, se puede observar claramente el crecimiento de nanobacterias en el cultivo utilizando tintes fluorescentes de ADN (Dapi o Hoechst) para teñir el ADN nanobacteriano en las condiciones del ADN bacteriano ordinario, pero cuando se tiñe el ADN nanobacteriano; De acuerdo con las condiciones del ADN mitocondrial y del ADN viral, se puede observar la fluorescencia característica bajo un microscopio de fluorescencia. La tinción fluorescente con anticuerpos específicos contra nanobacterias también puede mostrar claramente la presencia de nanobacterias. Al observar las nanobacterias teñidas negativamente con un microscopio electrónico, podemos mostrar claramente el tamaño de las nanobacterias individuales o agrupadas de 80 a 350 nm y la estructura de la biopelícula en su superficie. El uso de microscopía electrónica de transmisión para observar secciones ultrafinas de nanobacterias puede mostrar claramente sus estructuras internas.
Se pueden encontrar las siguientes características:
(1) Nacer con células * * *. Si las células crecen bien o tienen una alta densidad, habrá menos pequeños puntos negros, y viceversa.
(2) Ineficaz contra los antibióticos;
(3) Puede estar contaminado por el aire en la incubadora.
(4) Cuando se utiliza medio de cultivo y suero; Solo, no se encontró ningún problema.
(5) Tampoco es eficaz incluso después del lavado.
Las siguientes son publicaciones relacionadas que encontré en el foro.
El "gusano pegamento" es un tipo de contaminante celular descubierto en los últimos diez años. La clasificación del "gusano negro" aún no ha sido determinada.
El "gusano del pegamento negro" puede parasitar células animales o vivir en el medio de cultivo. Vive de los nutrientes de las células y del medio de cultivo y se hereda a medida que las células se transmiten. Los "gusanos del pegamento negro" compiten con las células por el crecimiento y al principio no tienen ningún efecto sobre las células. Sin embargo, cuando el número de gusanos del pegamento negro alcanza un cierto nivel, el crecimiento de las células se verá afectado hasta que mueran, lo que afectará gravemente el desarrollo y el progreso. de las actividades de investigación científica. Por lo tanto, cuando se cambian las condiciones de cultivo, se reduce la densidad de siembra de células y el estado de las células es deficiente, a menudo se produce contaminación por "gusano de pegamento negro", lo que interrumpe el experimento, especialmente cuando se resucitan células congeladas, lo que puede causar una gran cantidad de muertes celulares.
Generalmente se cree que el "gusano del pegamento negro" es un microorganismo que prolifera lentamente pero que es perjudicial para las células. Cuando el número alcanza un cierto nivel, puede causar la muerte celular. La fuente puede ser la contaminación de las propias células o la contaminación al tomar materiales de animales. Este tipo de contaminación prevalece en los laboratorios celulares de todo el mundo y resolver este problema es un problema mundial.
Discusión sobre ¿qué es?
A. Algo similar a la sílice en una botella de cultivo de vidrio (reportado en la literatura)
b: Se dice que es un gusano de pegamento negro, y algunas personas dicen que lo es. un protozoo. No parece haber una declaración unificada.
C. Identificado por el Instituto de Virología y la Academia de Ciencias Militares, es un protozoo que vive en el suero bovino y parece ser similar a Paramecium y Amoeba. Sin embargo, debido a la insuficiencia de fondos para el proyecto, no pudo continuar.
D. Algunas personas dicen que son bacterias a nanoescala.
Otras características
(1) Tienen forma de bacteria, con un diámetro de aproximadamente 0,5~1. micrón.
(2) El microscopio invertido de 400x es más pequeño y tiene el típico movimiento browniano (jitter in situ irregular a distancias pequeñas).
(3) Parece existir en las células,
(4) Pero no provoca turbidez en la solución de cultivo.
(5) Con el tiempo, el estado de la célula se deteriora significativamente y eventualmente muere.
Cómo lo maneja cada uno:
1. Cambiar a un suero mejor (creo que tiene poco que ver con el suero).
2. Si las células están adherentes, se pueden lavar varias veces con PBS estéril, lo que puede aliviar en cierta medida el problema. Si se trata de una suspensión, será difícil de manejar. Puede agregar menos trofoblasto (los macrófagos extraídos de la cavidad peritoneal de ratones no se dividirán ni morirán después de un período de tiempo, como deben saber quienes realizan fusiones de hibridomas de anticuerpos). ¡Agregar una capa trófica es muy efectivo para las células recién resucitadas del gusano pegamento negro! También existe la necesidad de prestar atención al entorno experimental y mantener limpio todo el entorno entre las células.
3. En su lugar, utilice botellas de cultivo de plástico desechables importadas.
4. Se recomienda limpiar, esterilizar y fumigar con KMnO4 todos los elementos de la sala estéril, y las células deben resucitar según el primer uso de la sala estéril.
5. Antes de cambiar el medio, agregue solución salina fisiológica y dé golpecitos suaves. Después del lavado, agregue el medio de cultivo todos los días. Agregue solución salina fisiológica y centrifugue nuevamente durante el paso. . Después de un período de tiempo, la cantidad de insectos se reducirá considerablemente y el crecimiento de las células no se verá muy afectado.
6. Existe información de que la minociclina tiene cierto efecto y puede usarse junto con el intercambio de líquidos.