¿Qué es la PCR?
Una breve historia de la tecnología PCR
Han pasado más de 65.438+0.000 años desde que se concibió por primera vez la PCR para estudiar ácidos nucleicos. A finales de los años 1960 y principios de los años 1970, la gente se dedicó a la investigación del aislamiento de genes in vitro. En 65,438+0,976,5438+0, Korana propuso por primera vez la idea de la amplificación de ácido nucleico in vitro: "Después de la desnaturalización del ADN, la hibridación con cebadores apropiados, la extensión de los cebadores con ADN polimerasa y la repetición de este proceso, se puede lograr la clonación". del gen tRNA".
Realización de la PCR En 1985, Mullis, del Laboratorio de Genética Humana de la empresa PE-Setus en Estados Unidos, inventó la reacción en cadena de la polimerasa que hizo época. Su principio es similar al de la replicación del ADN in vivo, pero proporciona condiciones adecuadas para la síntesis de ADN in vitro en tubos de ensayo: ADN molde, cebadores oligonucleotídicos, ADN polimerasa, sistema tampón apropiado, desnaturalización del ADN, renaturalización y temperatura y tiempo prolongados.
Mejora y perfección de la PCR La ADN polimerasa original utilizada por Mullis es el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Tiene las siguientes desventajas: ① La enzima Klenow no es resistente a altas temperaturas y se desnaturalizará e inactivado a 90°C. Cada ciclo requiere Agregar nuevamente. ② La reacción de extensión del cebador se realiza a 37 ° C y es probable que se produzcan discrepancias de bases entre la plantilla y el cebador. La especificidad del producto de la PCR es deficiente y los fragmentos de ADN sintetizados son desiguales. Aunque esta tecnología de PCR catalizada por enzima Klenow tiene muchas ventajas sobresalientes en comparación con la amplificación genética tradicional, la enzima Klenow no es resistente al calor y se inactivará cuando la plantilla de ADN se desnaturalice térmicamente, y cada adición de enzima solo puede completar un paso. El ciclo de reacción de amplificación añade muchas dificultades a los procedimientos operativos de la tecnología de PCR. Esto ha impedido que la tecnología de PCR atraiga suficiente atención en el campo biomédico durante algún tiempo. A principios de 1988, Keohanog utilizó ADN polimerasa T4 para realizar la PCR. Los fragmentos de ADN amplificados eran muy uniformes y muy auténticos, y solo se esperaba un fragmento de ADN. Sin embargo, en cada ciclo aún es necesario agregar nuevas enzimas. En 1988, Zhaisi et al. extrajeron una ADN polimerasa termoestable de una bacteria termófila acuática aislada de aguas termales. La enzima tiene las siguientes características: ① Resistencia a altas temperaturas, la actividad restante es superior al 90 % después de 2 horas a 70 °C, la actividad restante es superior al 60 % después de 2 horas a 93 °C y la actividad restante es mayor del 40% después de 2 horas a 95°C. ② No se pasivará durante la desnaturalización térmica y no es necesario agregar nuevas enzimas después de cada reacción de amplificación. ③La especificidad y la eficiencia de amplificación de los fragmentos amplificados mejoran enormemente y la longitud de amplificación aumenta (2,0 Kb). Debido a que se mejoran la especificidad y eficiencia de la amplificación, su sensibilidad también mejora considerablemente. Para distinguirla del fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, la enzima se denominó Taq ADN polimerasa. El descubrimiento de esta enzima condujo al uso generalizado de la PCR.
Principios básicos de la tecnología PCR
Los principios básicos de la tecnología PCR son similares al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad depende de cebadores oligonucleotídicos que son complementarios a ambos extremos del secuencia objetivo.
La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización-hibridación-extensión: ① Desnaturalización del ADN molde: después de calentar el ADN molde a aproximadamente 93 °C durante un cierto período de tiempo, el ADN bicatenario del ADN molde o el doble -El ADN amplificado por PCR se disocia en ADN monocatenario, de modo que pueda combinarse con el cebador para prepararse para la siguiente ronda de reacción (2) Recocido (renaturalización) del ADN molde y el cebador: después del molde; El ADN se calienta y se desnaturaliza en una sola hebra, la temperatura se enfría a aproximadamente 55 °C y el cebador y el ADN molde forman un emparejamiento de secuencia complementaria de la hebra. ③ Extensión del cebador: bajo la acción de la TaqDNA polimerasa, la El conjugado plantilla-cebador de ADN utiliza dNTP como materia prima de reacción y la secuencia objetivo como plantilla. Basado en los principios de emparejamiento de bases y replicación semiconservativa, se sintetiza un conjugado plantilla-cebador de ADN con una nueva cadena de replicación semiconservadora. complementaria a la cadena de ADN plantilla, y repitiendo los tres procesos de desnaturalización-hibridación-extensión, se pueden obtener más "cadenas de replicación semiconservadoras". Esta nueva cadena se puede utilizar como plantilla para el siguiente ciclo. Se necesitan de 2 a 4 minutos para completar un ciclo y el gen objetivo que se va a amplificar se puede amplificar un millón de veces en 2 a 3 horas. El número de ciclos necesarios para alcanzar una meseta depende del número de copias de la plantilla en la muestra.
Cinética de reacción de la PCR Los tres pasos de reacción de la PCR se repiten, provocando que la amplificación del ADN aumente exponencialmente. La cantidad final de amplificación de ADN se puede calcular usando y = (1+x) n, donde Y representa el número de copias del fragmento de ADN amplificado, X representa la eficiencia de amplificación promedio de cada vez (Y) y N representa el número de ciclos. . El valor teórico de la eficiencia de amplificación promedio es del 100%, pero en reacciones reales la eficiencia promedio no alcanza el valor teórico. En las etapas iniciales de la reacción, los fragmentos de ADN de la secuencia objetivo crecen exponencialmente. Con la acumulación gradual de productos de PCR, los fragmentos de ADN amplificados ya no crecen exponencialmente, sino que entran en una fase de crecimiento lineal o estacionaria, es decir, se produce un "efecto de estancamiento", que se denomina número de fases de meseta, amplificación por PCR. eficiencia y polimerización del ADN. Tipo y actividad de la enzima PCR y competencia por productos no específicos. En la mayoría de los casos, una meseta es inevitable.
Los productos de amplificación por PCR se pueden dividir en dos partes: fragmentos largos de producto y fragmentos cortos de producto. La longitud de los fragmentos cortos del producto está estrictamente limitada entre los extremos 5' de las dos cadenas del cebador y es el fragmento específico que debe amplificarse. Se forman fragmentos de producto cortos y fragmentos de producto largos porque los cebadores se unen a diferentes plantillas. Tome una plantilla original como ejemplo. En el primer ciclo de reacción, se utilizan dos ADN complementarios como plantillas. Los cebadores se extienden desde el extremo 3' y el extremo 5' está fijo. Sin embargo, no hay un punto de terminación fijo en el extremo 3', por lo que las longitudes son diferentes. . Este es el "fragmento largo del producto". Después de ingresar al segundo ciclo, el cebador no solo se unirá a la plantilla original, sino también a la cadena recién sintetizada (es decir, el "fragmento largo del producto"). Cuando el cebador se combina con la nueva cadena, la secuencia del extremo 5' de la plantilla de la nueva cadena se fija, lo que significa que el extremo 3' del fragmento extendido se fija, lo que garantiza que el punto inicial y final del nuevo fragmento se limitan al punto de amplificación del cebador. Dentro de la secuencia de amplificación, se forma un "fragmento de producto corto" de la misma longitud. No es difícil ver que los "fragmentos de producto cortos" aumentan exponencialmente, mientras que los "fragmentos de producto largos" aumentan aritméticamente, lo que es casi insignificante. Esto elimina la necesidad de purificar nuevamente los productos de la reacción de PCR y garantiza que haya suficientes fragmentos de ADN puro. para su uso.
Sistema de reacción PCR y condiciones de reacción
Sistema de reacción PCR estándar:
10×tampón de amplificación 10ul
Cuatro mezclas de dNTP cada una de ellas es 200 µmol/L.
Cada cebador es de 10 ~ 100 pmol.
Plantilla ADN 0.1 ~ 2ug
Taq ADN polimerasa 2.5u
Mg2+1.5 mmol/L
A 100 μl Añadir doble o partes triples de agua destilada.
Cinco elementos de la reacción de PCR: Hay cinco sustancias principales involucradas en la reacción de PCR: cebador, enzima, dNTP, plantilla y Mg2+.
Cebadores: Los cebadores son la clave para la reacción específica de la PCR. La especificidad del producto de la PCR depende del grado de complementariedad entre el cebador y el ADN molde. Teóricamente, siempre que se conozca la secuencia de cualquier ADN molde, se pueden diseñar cadenas de oligonucleótidos complementarias basadas en ella como cebadores para amplificar el ADN molde in vitro mediante PCR.
El diseño de los cebadores debe seguir los siguientes principios:
① Longitud del cebador: 15-30 pb, normalmente alrededor de 20 pb.
② Intervalo de amplificación del cebador: 200-500 pb es apropiado y puede amplificarse hasta un fragmento de 10 kb en determinadas condiciones.
③ Bases de cebador: el contenido de G+C debe ser del 40 al 60%. Muy poco G+C no favorece la amplificación y demasiado G+C puede producir fácilmente bandas no específicas. Los ATGC se distribuyen preferentemente de forma aleatoria para evitar agrupaciones de más de 5 nucleótidos de purina o pirimidina.
(4) Evitar estructuras secundarias en los cebadores y evitar la complementariedad entre dos cebadores, especialmente el extremo 3’, de lo contrario se formarán dímeros de cebador y se producirán bandas de amplificación no específicas.
⑤Las bases en el extremo 3' del cebador, especialmente la última y penúltima base, deben coincidir estrictamente para evitar que las bases terminales no coincidan y provoquen fallas en la PCR.
⑥ Existe o puede haber un sitio de restricción adecuado en el cebador. Lo mejor es tener un sitio de restricción adecuado para la secuencia diana amplificada, lo cual es muy beneficioso para el análisis de restricción o la clonación molecular.
⑦ Especificidad del cebador: el cebador no debe tener ninguna homología obvia con otras secuencias en la base de datos de secuencias de ácidos nucleicos.
Cantidad de imprimador: la concentración de cada imprimador es de 0,1 ~ 1 umol o 10 ~ 100 pmol. La cantidad más baja de imprimador produce mejor los resultados deseados. Las concentraciones más altas de cebadores pueden causar desajustes y amplificación inespecífica, lo que aumenta la posibilidad de que se formen dímeros entre los cebadores.
Actualmente existen dos tipos de Taq ADN polimerasa, una es una enzima natural purificada de Bacillus hydrothermalis y la otra es una enzima genéticamente sintetizada por E. coli. Se requieren aproximadamente 2,5 U de enzima para catalizar una reacción de PCR típica (cuando el volumen total de reacción es de 100 ul). Si la concentración es demasiado alta, provocará una amplificación no específica, y si la concentración es demasiado baja, se reducirá la cantidad de producto sintetizado.
La calidad y concentración de dNTP están estrechamente relacionadas con la calidad y concentración de dNTP y la eficiencia de la amplificación por PCR. El polvo de dNTP es granular y puede perder fácilmente su actividad biológica si no se almacena adecuadamente. La solución de DNTP es ácida y debe prepararse con NaOH 1 M o Tris 1 M después de una alta concentración. Ajuste el valor de pH del tampón HCL a 7,0 ~ 7,5, tome alícuotas de una pequeña cantidad y congele a -20 °C. La congelación y descongelación repetidas degradarán los dNTP. En la reacción de PCR, el dNTP debe estar en 50 ~ 200 μmol/L, especialmente las concentraciones de los cuatro dNTP deben ser iguales (preparación equimolar). Si alguno de ellos es diferente de los demás (mayor o menor), habrá un desajuste. Una concentración demasiado baja reducirá el rendimiento de los productos de PCR. El DNTP puede combinarse con Mg2+ y reducir la concentración de Mg2+ libre.
Ácido nucleico plantilla (gen diana) La cantidad y el grado de purificación del ácido nucleico plantilla son uno de los factores clave en el éxito de la PCR. Los métodos tradicionales de purificación de ADN suelen utilizar SDS y proteinasa K para digerir y procesar muestras. La función principal del SDS es disolver los lípidos y las proteínas de la membrana celular, disolviendo así las proteínas de la membrana, destruyendo la membrana celular y liberando las proteínas nucleares de las células. El SDS también puede unirse a proteínas y precipitar; la proteinasa K puede hidrolizar y digerir proteínas, especialmente histonas unidas al ADN, y luego usar solventes orgánicos fenol y cloroformo para extraer proteínas y otros componentes celulares, y usar etanol o isopropanol para precipitar ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos extraídos se pueden utilizar como plantillas para reacciones de PCR. En muestras clínicas generales, se puede utilizar un método rápido y sencillo para lisar células, lisar patógenos, digerir proteínas cromosómicas y liberar el gen objetivo para la amplificación directa por PCR. Las plantillas de ARN generalmente se extraen utilizando el método de isotiocianato de guanidinio o proteinasa K para evitar que la RNasa degrade el ARN.
La concentración de Mg2+ tiene un impacto significativo en la especificidad y el rendimiento de la amplificación por PCR. En una reacción de PCR general, cuando la concentración de varios dNTP es de 200 μmol/L, la concentración apropiada de Mg2+ es de 1,5 ~ 2,0 mmol/L. Si la concentración de Mg2+ es demasiado alta, la especificidad de la reacción se reducirá y se reducirá. se producirá un aumento no específico. Si la concentración es demasiado baja, se reducirá la actividad de la ADN polimerasa Taq y también se reducirán los productos de reacción.
Selección de las condiciones de reacción de la PCR
Las condiciones de reacción de la PCR son temperatura, tiempo y número de ciclos.
Ajuste de temperatura y tiempo: Basado en el principio de la PCR, se establecen tres puntos de temperatura de desnaturalización, recocido y extensión. En la reacción estándar, se utiliza el método de los tres puntos de temperatura. El ADN de doble cadena se desnaturaliza a 90 ~ 95°C y luego se enfría rápidamente a 40 ~ 60°C. Después de la hibridación, el cebador se une a la secuencia objetivo y luego se calienta rápidamente a 70 ~ 75 °C. La cadena del cebador se extiende a lo largo de la plantilla mediante la ADN polimerasa Taq.
Para genes diana más cortos (de 100 a 300 BP de longitud), se puede utilizar un método de punto de temperatura dual, que puede combinar temperaturas de recocido y extensión además de la temperatura de desnaturalización. Generalmente, se desnaturaliza a 94 °C y se recoce y extiende a aproximadamente 65 °C (a esta temperatura, la Taq DNasa todavía tiene una alta actividad catalítica).
① Temperatura y tiempo de desnaturalización: La baja temperatura de desnaturalización y la fusión incompleta son las principales razones del fallo de la PCR. En términos generales, un LMIN de 93°C ~ 94°C es suficiente para desnaturalizar el ADN molde. Si es inferior a 93°C, es necesario ampliar el tiempo, pero la temperatura no puede ser demasiado alta, porque el ambiente de alta temperatura tiene un impacto en la actividad de la enzima. Si la plantilla del gen diana o el producto de la PCR no se pueden desnaturalizar completamente en este paso, la PCR fallará.
② Temperatura y tiempo de recocido (renaturalización): la temperatura de recocido es un factor importante que afecta la especificidad de la PCR. Después de la desnaturalización, enfríe rápidamente a 40 °C ~ 60 °C para permitir que los cebadores se unan a la plantilla. Debido a que el ADN molde es mucho más complejo que el cebador, la probabilidad de unión por colisión entre el cebador y el molde es mucho mayor que entre las hebras complementarias del molde. La temperatura y el tiempo de hibridación dependen de la longitud, la composición de bases y la concentración del cebador y la longitud de la secuencia diana. Para un cebador de 20 nucleótidos y un 50 % de contenido de G+C, 55 °C es un punto de partida ideal para seleccionar la temperatura de recocido óptima. La temperatura de renaturalización de la imprimación se puede utilizar para ayudar a seleccionar la temperatura adecuada mediante la siguiente fórmula:
Valor Tm (temperatura de fusión) = 4 (g+c)+2 (a+t)
Temperatura de replegamiento = valor Tm - (5 ~ 10 ℃)
Dentro del rango permitido de valor Tm, elegir una temperatura de renaturalización más alta puede reducir en gran medida la unión no específica de cebadores y plantillas y mejorar la eficiencia de las reacciones de PCR. El tiempo de renaturalización es generalmente de 30 a 60 segundos, que es suficiente para combinar completamente el cebador y la plantilla.
③Temperatura y tiempo de extensión: actividad biológica de la ADN polimerasa Taq
70 ~ 80 ℃ 150 nucleótidos/segundo/molécula de enzima
70 60 nucleótidos/segundo/; molécula de enzima a ℃
24 nucleótidos/segundo/molécula de enzima a 55 ℃
Cuando la temperatura es superior a 90 ℃, la síntesis de ADN casi no puede continuar.
La temperatura de extensión de la reacción de PCR es generalmente de 70 ~ 75 ℃, y la temperatura común es de 72 ℃. Una temperatura de extensión excesivamente alta no favorece la unión de cebadores y plantillas. El tiempo de la reacción de extensión de la PCR depende de la longitud del fragmento a amplificar. Generalmente, para fragmentos de ADN de menos de 1 Kb, un tiempo de extensión de 1 minuto es suficiente. Una secuencia objetivo de 3 a 4 KB tarda de 3 a 4 minutos; la amplificación de 10 Kb debe ampliarse a 15 minutos. Una extensión excesiva puede provocar la aparición de bandas amplificadas inespecíficas. Para la amplificación de bajas concentraciones de plantilla, el tiempo de extensión es ligeramente mayor.
El número de ciclos determina el grado de amplificación por PCR. El número de ciclos de PCR depende principalmente de la concentración de ADN molde. Generalmente el número de ciclos está entre 30 y 40. Cuantos más ciclos, más productos no específicos.
Características de las reacciones de PCR
Los determinantes específicos de las reacciones de PCR altamente específicas son:
①La combinación específica y correcta de cebadores y ADN molde;
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②El principio del emparejamiento de bases;
③La autenticidad de la reacción de síntesis de la ADN polimerasa Taq;
④La especificidad y conservación del gen objetivo.
La combinación correcta de primers y plantillas es clave. La unión del cebador al molde y la extensión de la cadena del cebador siguen el principio de apareamiento de bases. Debido a la fidelidad de la reacción de síntesis de la polimerasa y la resistencia a altas temperaturas de la ADN polimerasa Taq, la combinación (renaturalización) de la plantilla y los cebadores en la reacción se puede llevar a cabo a una temperatura más alta, la especificidad de la combinación aumenta considerablemente. y el gen objetivo amplificado es Los fragmentos pueden mantener una alta precisión. Al seleccionar regiones genéticas objetivo con alta especificidad y conservación, la especificidad será mayor.
La cantidad de productos de PCR con alta sensibilidad aumenta exponencialmente, y la plantilla inicial a analizar se puede amplificar desde un nivel de picogramos (pg=10-12g) hasta un nivel de microgramos (ug=10-6g). Se puede detectar una célula diana entre 654,38+0 millones de células; en la detección de virus, la sensibilidad de la PCR puede alcanzar 3 RFU (unidades formadoras de placa), la tasa de detección más baja es de 3 bacterias;
Reacción de PCR sencilla y rápida utilizando ADN polimerasa Taq resistente a altas temperaturas.
Después de agregar la solución de reacción de una vez, la reacción de desnaturalización-hibridación-extensión se realiza en la solución de amplificación de ADN y en un baño de agua. La reacción de amplificación generalmente se completa en 2 a 4 horas. Los productos de amplificación generalmente se analizan mediante electroforesis, que no requiere isótopos, por lo que no hay contaminación radiactiva y es fácil de promover.
La pureza de la muestra es baja y no es necesario aislar virus ni bacterias ni cultivar células. Se pueden utilizar ADN crudo y ARN total como plantillas de amplificación. Se puede utilizar directamente para amplificar y detectar ADN bruto a partir de muestras clínicas como sangre, fluidos de cavidades corporales, enjuagues bucales, cabello, células y tejido vivo. Análisis de productos de amplificación por PCR
Si el producto de PCR está específicamente amplificado y si el resultado es preciso y confiable debe someterse a un análisis e identificación estrictos para sacar la conclusión correcta. El análisis de productos de PCR puede utilizar diferentes métodos de análisis según los diferentes objetos y propósitos de investigación.
Análisis de electroforesis en gel: electroforesis del producto por PCR, tinción con bromuro de etidio EB y observación UV para determinar inicialmente la especificidad del producto. El tamaño de los fragmentos del producto de la PCR debe ser coherente con el tamaño esperado. Especialmente para la PCR múltiple, que utiliza varios pares de cebadores, los fragmentos del producto deben ser coherentes con el tamaño esperado.
Electroforesis en gel de agarosa: normalmente se utiliza gel de agarosa del 1 al 2% para la detección.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: el efecto de separación de la electroforesis en gel de poliacrilamida al 6 ~ 10% es mejor que el de la agarosa. Las bandas están concentradas y pueden usarse para investigación científica y análisis de detección.
Análisis de digestión enzimática: De acuerdo con los sitios de endonucleasa de restricción en el producto de la PCR, mediante la correspondiente digestión enzimática y separación por electroforesis, se obtienen fragmentos que se ajustan a la teoría. Este enfoque permite no sólo la identificación del producto sino también la clasificación de genes diana y el estudio de su variabilidad.
Hibridación molecular: la hibridación molecular es una prueba sólida para detectar la especificidad de los productos de PCR y también es un método eficaz para detectar mutaciones de bases en productos de PCR.
Hibridación por transferencia Southern: Se sintetiza otra hebra de oligonucleótido (oligonucleótido interno) entre los dos cebadores y se marca como sonda para hibridar con el producto de la PCR. Este método no sólo se puede utilizar para una identificación específica y mejorar la sensibilidad de la detección de productos de PCR, sino que también puede conocer su peso molecular y tipo de banda, que se utiliza principalmente para investigaciones científicas.
Hibridación de puntos: coloque el producto de PCR en una membrana de nitrocelulosa o membrana de nailon y luego hibridelo con la sonda de oligonucleótido interna para observar si hay manchas de color. Se utiliza principalmente para la identificación específica de productos de PCR. y análisis de variaciones.
Análisis de secuencia de ácidos nucleicos: Detectar la especificidad de los productos de PCR es el método más factible.