¿Qué es el modelo compuesto latino de Mason?
Wang Yaping Zhu Zuoyan
Principios y estrategias de la focalización genética
Wang Yaping Zhu Zuoyan
(chino Instituto de Investigación de Biología Acuática de la Academia de Ciencias, Wuhan 430072)
La focalización genética es una importante tecnología de biología molecular desarrollada en la década de 1980. Es una tecnología que modifica y transforma sitios específicos del genoma mediante recombinación homóloga entre ADN exógeno y ADN cromosómico.
1Recombinación homóloga
La recombinación homóloga es la base biológica molecular de la tecnología de focalización de genes. La recombinación homóloga del ADN desempeña un papel importante en la transformación genética y la diversidad genética y ha atraído la atención de muchos investigadores. Desde la década de 1960, el mecanismo de recombinación homóloga en sistemas fúngicos se ha estudiado sistemáticamente [1] y se han propuesto varios modelos de recombinación homóloga.
1.1 Modelo de vacaciones [2]
El modelo propuesto por Holliday et al. en la década de 1960 fue el primer modelo de recombinación homóloga generalmente aceptado, que pasaba por cadenas de ADN híbridas y. La reparación posterior del ADN se utilizó para explicar el fenómeno de la transformación genética en los hongos, estableciendo así el concepto básico del intercambio de información genética entre secuencias de ADN homólogas. Los elementos básicos del modelo de vacaciones, como la estructura de vacaciones, la traducción cruzada, etc., tienen un impacto importante en muchos modelos futuros de recombinación homóloga. Las observaciones de microscopía electrónica de la recombinación del ADN realizadas por Potter et al. [3] proporcionaron evidencia directa de la estructura de Holliday de este modelo.
1.2 Modelo Meselson-Latin [4]
Meselson y Radding hicieron algunas mejoras basándose en el modelo de Holliday, creyendo que la formación de una sola cadena de ADN y su invasión al ADN adyacente se duplica. hebras es asimétrica, se propone el modelo de Meselson-Radding. La formación de cadenas simples de ADN puede ocurrir primero en cadenas dobles de ADN. A medida que la cadena de ADN en la brecha se repara y sintetiza, el extremo libre de la cadena simple invade la doble cadena de ADN adyacente y se combina con la parte homóloga, y la cadena de ADN reemplazada forma un bucle D que aumenta gradualmente. Una vez que se rompe el bucle D, los extremos monocatenarios se cruzan en cadenas dobles de ADN adyacentes y los extremos libres del ADN se conectan con enlaces de valencia para formar una estructura de Holliday. El modelo de Meselson-Radding vinculó por primera vez la síntesis y la recombinación del ADN. Este mecanismo de formación de cadenas híbridas de ADN parece ser más apropiado para explicar el fenómeno de la recombinación asimétrica [1].
1.3 Modelo de reparación de roturas de doble cadena
En el estudio de la recombinación del sistema de levaduras, se descubrió que las roturas de doble cadena en el ADN vectorial pueden mejorar en gran medida la eficiencia de la recombinación homóloga, ya sea es Holliday o Meselson. Ninguno de los modelos de Radding puede explicar bien este fenómeno. Basándose en este descubrimiento, Szostak et al. propusieron el modelo de reparación de roturas de doble hebra (DSBR) [5]. En este modelo, la recombinación se produce en la región de rotura de la doble hebra del ADN. La reparación de la región de rotura utiliza la correspondiente cadena de ADN homóloga como plantilla. La región de rotura reparada se convierte esencialmente en la zona de transformación. Los extremos del ADN se unen mediante valencia * * * para formar dos estructuras Holliday, cada una de las cuales tiene dos soluciones, ya sea un dúplex intercambiado o un dúplex no intercambiado. La transformación genética no requiere la formación de cadenas híbridas de ADN ni procesos posteriores de corrección y reparación de errores. Existe otra diferencia importante entre el modelo DSBR y el modelo Meselson-Latin. La rotura de doble hebra en el primero es el área receptora de información, y la rotura del ADN en el segundo es el proveedor de información genética.
1.4 Modelo de recocido monocatenario
En 1984, Lin et al. propusieron un modelo de recocido monocatenario (SSA) completamente diferente. En el modelo SSA, la recombinación comienza con una rotura de la doble cadena del ADN. Bajo la acción de una exonucleasa específica de cadena sencilla, se forman gradualmente regiones monocatenarias de ADN a ambos lados del punto de rotura. Este proceso continúa hasta que aparecen cadenas sencillas de ADN complementarias en los dos puntos de rotura. Recocido monocatenario de ADN complementario, eliminación de extremos no complementarios, reparación y ligadura de espacios monocatenarios y finalización de la recombinación del ADN. El modelo SSA no tiene el proceso de reconocimiento y emparejamiento del ADN bicatenario requerido por otros modelos, ni forma una estructura Holliday como forma de transición intermedia para la recombinación. Por lo tanto, la recombinación produce invariablemente un intercambio de ADN de doble cadena, lo que resulta en la pérdida de secuencias de ADN de una sola cadena en la región sin hibridación. Este modelo proporciona una nueva perspectiva sobre la comprensión del mecanismo de recombinación homóloga.
Además del modelo anterior, diferentes investigadores han propuesto un modelo que da lugar a otras reorganizaciones.
Rao et al. descubrieron que con la participación de la proteína RecA, las moléculas de ADN monocatenario ingresan al surco principal de la doble hélice del ADN y forman una estructura triple estable en la región homóloga [7]. Otros grupos de investigación también han descubierto estructuras de ADN de triple hebra similares y creen que la estructura de triple hebra de las moléculas de ADN puede desempeñar un papel importante en el reconocimiento y la recombinación de secuencias homólogas [8].
La recombinación homóloga puede ocurrir no sólo entre moléculas de ADN, sino también entre moléculas de ARN o entre moléculas de ARN y ADN. Stuhlmann et al. encontraron que el ARN retroviral sufre una recombinación homóloga de alta frecuencia durante la transcripción inversa [9]. Este fenómeno también se ha confirmado en otros virus de ARN [10, 11]. La investigación de Derr et al. en la levadura Saccharomyces cerevisiae encontró además que las moléculas de ARN pueden mediar en la recombinación homóloga del ADN genómico a través de la vía del ADNc y propusieron un modelo de recombinación mediada por ARN [12]. Las moléculas entre ARN y la recombinación homóloga mediada por ARN pueden proporcionar nuevas vías para la variación del genoma.
2 Manipulación de objetivos genéticos
A finales de los años 1970 y mediados de los 1980, se estableció la base de la tecnología de orientación genética utilizando Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo [13]. El establecimiento de una tecnología de selección de genes se basa en varios avances importantes: el establecimiento de métodos para introducir ADN exógeno en células de levadura; el desarrollo y utilización de genes marcadores de selección eficaces (como los genes LEU2 y URA3) y el establecimiento de un sistema de detección de transformantes por recombinación homóloga. sistema; el descubrimiento de la rotura del ADN bicatenario en la secuencia homóloga del vector objetivo aumenta la eficacia de la recombinación homóloga. La investigación modelo estableció importantes parámetros técnicos para las operaciones de selección de genes y gradualmente formó una estrategia de investigación madura.
2.1 Vectores de inserción y vectores de desplazamiento
Hay dos tipos de vectores de manipulación de dianas genéticas, a saber, vectores de inserción y vectores de reemplazo. La diferencia radica en la ubicación de la rotura de doble hebra en la secuencia homóloga del ADN en el vector. El sitio de escisión insertado en el vector está en la secuencia diana homóloga y el gen de selección puede estar en cualquier parte del vector. El vector y el sitio objetivo cromosómico se intercambian una vez para completar la recombinación homóloga. El resultado es que todo el vector se integra en el sitio objetivo cromosómico (Figura 1, A); fuera de la secuencia diana homóloga. Seleccionar genes dentro de secuencias diana homólogas. La secuencia diana homóloga del vector se intercambia con la diana cromosómica dos veces para completar la recombinación homóloga. El resultado de la recombinación es que la secuencia diana homóloga del vector reemplaza la secuencia diana cromosómica (Figura 1, B).
Figura 1 Estrategia de mutación fina del gen (a. Estrategia de avance y retroceso; b. Estrategia de intercambio de etiquetas)
En cuanto a la eficiencia de la recombinación homóloga de dos tipos diferentes de vectores, algunos estudios han encontrado que el vector de inserción La eficiencia de recombinación es mayor y su mecanismo de recombinación está cerca del modelo de recombinación de reparación de roturas de doble hebra, mientras que el mecanismo de recombinación del vector de reemplazo aún no está claro [14]. Deng et al. compararon las eficiencias de recombinación homóloga de 22 secuencias de vectores diferentes en el sitio Hprt en células es de ratón y encontraron que no había diferencias en la eficiencia de recombinación de los dos tipos de vectores de direccionamiento de genes [15].
2.2 Eliminación genética y mutación genética fina
Los métodos genéticos tradicionales y los métodos bioquímicos in vitro están limitados por muchos factores en el estudio de la regulación de la expresión génica y las funciones fisiológicas del producto. La aparición de la tecnología de selección de genes permite introducir genes mutados in vitro en el genoma de los organismos, lo que permite estudiar la regulación de la expresión genética y las funciones fisiológicas a nivel celular y del organismo. Hay dos formas principales de transformar genes específicos del genoma utilizando tecnología de selección genética: eliminación de genes y mutación fina.
2.2.1 Eliminación genética La eliminación genética realiza una mutación por pérdida de función del gen diana in vitro, introduce el gen mutado en el genoma cromosómico mediante una operación de selección genética, elimina el gen endógeno de tipo salvaje y logra el gen diana en el cromosoma. Mutaciones de pérdida de función. Hay dos métodos principales para la eliminación de genes: uno consiste en formar dos mutaciones en el extremo 5 'y en el extremo 3' del gen objetivo clonado. Cada mutación provocará de forma independiente la pérdida de la función del gen. El gen objetivo mutado se introduce en el cromosoma. genoma a través de un vector de inserción. Este método requiere mutaciones efectivas en ambos extremos del gen diana, especialmente en el extremo 3', lo cual es técnicamente difícil. Los productos genéticos mutados a menudo conservan cierta actividad funcional. Por lo tanto, se debe probar la eficacia de las mutaciones antes de realizar operaciones de selección de genes. El gen diana mutado y el gen cromosómico diana pueden recombinarse dos veces en secuencias de genes homólogos en tándem, lo que da como resultado mutaciones de restauración. Por las razones anteriores, este esquema de eliminación de genes no se utiliza actualmente [16]. En segundo lugar, el gen marcador seleccionable se inserta directamente en el gen diana del vector, lo que suele ir acompañado de una pérdida parcial de la secuencia del gen diana, lo que da lugar a mutaciones de inserción y pérdida.
Antes de introducir el vector en la célula diana, se escinden ambos lados de la secuencia del gen mutante diana y el gen mutante se introduce en el genoma cromosómico en forma de un vector de reemplazo. En comparación con el esquema de inserción, el esquema de vector alternativo facilita la mutación in vitro del gen diana. Debido al mayor grado de mutación, no hay necesidad de comprobar la eficacia de la mutación antes de la operación de selección genética, y no es fácil para los transformantes recuperar mutaciones después de la operación de selección genética.
2.2.2 Mutación fina de genes El método de eliminación genética hace que un gen específico del genoma pierda su función. Es un método eficaz para estudiar la función básica de un gen y comprender su papel en la célula y el embrión. desarrollo. Sin embargo, existen relaciones complejas estructura-función entre la estructura genética y la función genética. Por ejemplo, la mayoría de las enfermedades genéticas humanas se basan en mutaciones a nivel de nucleótidos, y los métodos de eliminación de genes no pueden estudiar bien los cambios en la estructura fina de los genes. Además, los métodos de eliminación de genes también tienen algunas desventajas potenciales. Por ejemplo, los genes marcadores de selección positiva atrapados en el genoma no sólo causarán alteraciones a gran escala en las regiones cromosómicas, sino que los promotores o potenciadores que portan pueden desequilibrar la transcripción de genes adyacentes y producir fenotipos impredecibles [17]. Sobre la base de los métodos de eliminación genética, se han desarrollado una variedad de estrategias mejoradas para satisfacer las necesidades de la investigación de la estructura fina de los genes.
(1) Estrategia de avance y retirada: La estrategia de avance y retirada fue propuesta por primera vez por Hasty y Valancius, incluyendo dos procesos de recombinación homóloga. Por primera vez, el vector insertado se recombina homólogamente con el sitio diana del genoma, se introducen el gen mutante diana y el gen marcador y se obtienen clones celulares transformados en el medio de selección. La segunda recombinación homóloga ocurre espontáneamente entre el gen mutado diana en el genoma y el gen diana cromosómico. Como resultado, la columna vertebral del vector, los genes marcadores y los genes homólogos se desconectan secuencialmente y los genes mutantes diana introducidos pueden permanecer en el genoma. Este proceso de recombinación homóloga espontánea se llama recuperación. Los diferentes sitios cromosómicos objetivo tienen diferentes frecuencias de recuperación [17]. Los clones de transformantes se cribaron en el medio de selección correspondiente. Se puede utilizar PCR o hibridación Southern para detectar si el revertido contiene el gen mutante diana (Figura 1, A). Hasty et al. utilizaron una estrategia de avance y retroceso para introducir un código de terminación de la traducción en el extremo 3' del gen isotipo Hox-2.6 en células ES de ratón y obtuvieron una proteína mutante truncada en 43 aminoácidos [17]. Valancius et al. utilizaron un método similar para insertar una mutación de inserción de 4 bases en células ES de ratón Hprt- [18].
(2) Estrategia de intercambio de marcas: en 1993, Askew et al propusieron una nueva estrategia de mutación dirigida al sitio del genoma [19], a saber, la estrategia de intercambio de marcas. Incluye dos procesos. Primero, se usa un vector de reemplazo para introducir el gen marcador seleccionable en el sitio diana del genoma, y los clones de células somáticas transformadas se rastrean en el medio de selección correspondiente. En el segundo paso, se utiliza un vector de reemplazo para introducir la secuencia del gen mutante diana en la célula diana, y se obtienen transformantes de recombinación homólogos en el medio de selección, logrando así la mutación dirigida al sitio del gen diana en el cromosoma y eliminando el gen diana previamente insertó un gen marcador seleccionable en el gen diana (Figura 1, B).
Kuisha et al. introdujeron dos mutaciones de codones y tres mutaciones fenotípicas en el gen Na,K-ATPasa isomérica α2 no selectiva del genoma de las células ES de ratón mediante una estrategia de intercambio de marcas [19]. En la estrategia de intercambio de marcadores, el primer paso de selección de marcadores genéticos y el segundo paso de reemplazo del gen mutante objetivo son relativamente independientes, y las líneas celulares marcadas se pueden intercambiar con una variedad de genes mutantes objetivo. Por lo tanto, esta estrategia se puede utilizar para establecer modelos animales con defectos genéticos en una variedad de genes cromosómicos diana, lo cual es de gran importancia para el estudio de la estructura y función de los genes.
(3) Estrategia del sistema de recombinación Cre-loxP [20]: La estrategia del sistema de recombinación Cre-loxP propuesta por Gu et al. es una nueva forma de realizar mutaciones dirigidas al sitio del genoma. El sistema de recombinación Cre-loxP consta de dos partes: Cre recombinasa y sitio loxP. La recombinasa Cre está codificada por el gen Cre del fago P1 de E. coli. El sitio loxP es el sitio de recombinación específico para la enzima Cre y consta de dos secuencias repetidas invertidas de 13 pb y un espaciador de 8 pb. La recombinasa Cre puede eliminar un sitio loxP entre un fragmento de ADN y dos sitios loxP repetidos en la misma dirección, dejando un sitio loxP [21]. El sistema de recombinación Cre-loxP puede mediar la recombinación específica del sitio loxP en células de mamíferos y ratones transgénicos [22, 23, 24]. Gu et al. propusieron además una estrategia de recombinación de dos pasos que consiste en recombinación homóloga y recombinación específica de sitio.
En el primer paso, el gen marcador seleccionable se introduce en el sitio diana del genoma mediante recombinación homóloga a través del vector de reemplazo, y se introducen dos sitios loxP dispuestos en la misma dirección en ambos lados. En el segundo paso, a través de la recombinación específica del sitio loxP mediada por la recombinasa Cre, se eliminan todas las secuencias ubicadas entre los dos sitios loxP, mientras que las secuencias estructurales ubicadas fuera de ellos se retienen. Esta estrategia puede lograr diferentes efectos de modificación en el gen diana mediante el diseño de diferentes secuencias estructurales entre o fuera de los dos sitios. Gu et al. utilizaron esta estrategia por primera vez en células ES de ratón, mutando la secuencia eμ en el gen de la cadena pesada de inmunoglobulina mediante deleción dirigida al sitio y obteniendo ratones mutantes de este gen mediante tecnología de quimera de células embrionarias. El sistema de recombinación Cre-loxP no solo media en la eliminación específica sino también en la integración específica del sitio. Estudios anteriores han confirmado que el sistema de recombinación Cre-loxP puede mediar la integración específica del sitio de ADN exógeno en vectores virales [25]. Con el sistema de recombinación Cre-loxP se puede predeterminar con precisión la duración de la deleción del ADN y variarla dentro de un amplio rango. En las células embrionarias que expresan la recombinasa Cre, casi todas las secuencias entre los sitios loxP se eliminan [26]. Además, en comparación con otras estrategias, el tiempo de detección de las células ES transformadas es más corto y tiene menos impacto en la capacidad de reconstrucción embrionaria de las células ES [20]. Con base en las características anteriores, esta estrategia es de gran importancia para estudiar los elementos reguladores en cis de los genes.
2.3 Operaciones de focalización de genes en células de mamíferos
La aplicación de la tecnología de focalización de genes en células de mamíferos ha pasado por dos períodos. Los primeros estudios se centraron en la recombinación homóloga de genes marcadores exógenos. En el estudio inicial, dos genes neo con diferentes mutaciones de deleción se transfectaron en células, y los dos genes neo con diferentes mutaciones de deleción se recombinaron homólogamente para formar un gen neo de tipo salvaje y un gen neo doble mutante, que se integraron aleatoriamente en In del genoma celular, se generaron clones de células resistentes a G418. Estudios adicionales encontraron que la linealización de uno de los vectores de transformación aumentaba en gran medida el número de clones de células resistentes a G418, lo que coincide con lo que se ha observado en las operaciones de selección de genes de levadura. Estos resultados indican que el ADN exógeno puede someterse eficazmente a una recombinación homóloga en células de mamíferos [16]. Para estudiar más a fondo la eficacia de la recombinación homóloga entre secuencias de ADN exógeno y secuencias de ADN cromosómico, se recombinaron aleatoriamente genes marcadores defectuosos, como neo y HSV-tk, en el genoma cromosómico de las células, y se establecieron dianas de genes marcadores selectivos en el genoma. Se introduce otro tipo de secuencia mutante del gen marcador en las células transformadas y los clones recombinantes se exploran en el medio de selección correspondiente. Los estudios han confirmado que las secuencias de ADN exógeno introducidas en las células pueden recombinarse con secuencias de ADN objetivo endógenas, pero la tasa de recombinación homóloga es extremadamente baja, alrededor de 10-5 ~ 10-6.
Otro modelo de investigación utiliza genes marcadores seleccionables endógenos en células de mamíferos como objetivos para la mutagénesis dirigida. El gen hprt es un gen marcador endógeno ideal. El gen Hprt está vinculado al cromosoma X y existe como una copia única en las células ES de embriones masculinos. Por lo tanto, sólo se requiere una única copia de una mutación genética para obtener un fenotipo seleccionable. Las células Hprt+ y las células Hprt- se pueden seleccionar en medio HAT y medio 6-TG respectivamente. Doetschman et al. utilizaron tecnología de orientación genética para reparar con éxito células ES mutantes Hprt en ratones y obtuvieron células Hprt+ en medio HAT. Confirmaron que la mutación de tipo salvaje fue causada por recombinación homóloga de genes, y que la eficiencia de la recombinación homóloga fue de 1,4x. 10-6 [[ 30]]. Debido a que el fenotipo mutante del gen Hprt puede detectarse directamente, este gen se ha utilizado para estudiar modelos de operación objetivo de muchos genes [31, 32].
Las operaciones de selección de genes en células de mamíferos se enfrentan a dos dificultades principales [33]. Por un lado, el genoma de las células de los mamíferos es grande (más de 109 pb) y mucho más complejo que el de la levadura. Además, debido a las limitaciones de la tecnología de cultivo de células de mamíferos, la tasa de éxito de las operaciones de selección de genes en células de mamíferos es extremadamente baja. Por otro lado, las células de mamíferos parecen tener una gran capacidad para integrar aleatoriamente fragmentos de ADN extraños, y la proporción de recombinación homóloga a recombinación no homóloga es de aproximadamente 10-3 ~ 10-4 [29, 30, 31, 34, 35 ]. Por lo tanto, establecer un sistema de detección de transformantes eficiente y factible para operaciones de selección de genes es un requisito previo importante y una garantía técnica para las operaciones de selección de genes en células de mamíferos.
Autor: Instituto de Hidrobiología, Academia China de Ciencias, Wuhan 430072.
Referencia
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