Exoma completo
El exoma se refiere a la colección de todas las regiones exónicas del genoma humano, esta región representa sólo el 1%, pero contiene información importante necesaria para la síntesis de proteínas, abarcando aspectos relacionados con la mayoría de los fenotipos individuales. las variaciones funcionales. La secuenciación del exoma completo es un método de análisis del genoma que utiliza tecnología de captura de secuencias para capturar y enriquecer el ADN en la región del exón de todo el genoma y luego realiza una secuenciación de alto rendimiento. En comparación con la resecuenciación del genoma completo, la secuenciación del exoma tiene una cobertura de datos más profunda, mayor precisión y, al mismo tiempo, es más simple, más económica y más eficiente. Se ha utilizado ampliamente en enfermedades genéticas mendelianas, enfermedades complejas e investigación del cáncer.
Alta cobertura: cubre eficazmente exones y regiones UTR, con una profundidad de secuenciación promedio de más de 100
Alta profundidad de secuenciación: puede descubrir variantes comunes y variantes raras con una frecuencia inferior a 1 %
Altamente rentable: secuenciar el exoma y sus regiones cercanas, reduciendo efectivamente los costos, el tiempo del ciclo y la carga de trabajo
La mayoría de las enfermedades mendelianas monogénicas actualmente conocidas implican cambios en la secuencia codificante de proteína en el locus, con mutaciones patógenas ubicadas principalmente en la región del exón. Utilizando la tecnología de resecuenciación del exoma completo, se pueden encontrar todas las mutaciones en la región del exón de manera rápida y precisa, y los genes causantes de las enfermedades genéticas mendelianas se pueden extraer de manera más eficiente.
Por ejemplo:
Las enfermedades complejas se refieren a enfermedades que ocurren bajo la acción simultánea de muchos factores, como múltiples genes, múltiples mutaciones de un gen, efectos ambientales u otros factores desconocidos. Factores aleatorios y generalmente se cree que los patrones genéticos complejos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la diabetes, etc., tienen un impacto limitado y que su aparición por sí sola no es suficiente para causar enfermedad. En la actualidad, la industria aún carece de una comprensión integral del papel de las mutaciones raras en enfermedades complejas. La tecnología de secuenciación del exoma puede detectar con precisión mutaciones en la región codificante de histonas del genoma y es una forma rentable de analizar las causas. de enfermedades genéticas.
Investigación biómica en enfermedades complejas
El uso de la tecnología de secuenciación del exoma para detectar variaciones genéticas de mutaciones somáticas puede ayudar a los investigadores del cáncer a descubrir variaciones importantes en la patogénesis del cáncer humano y desempeñar un papel en vías del cáncer. La investigación juega un papel importante.
Selección de muestras e inspección de calidad> Construcción y captura de bibliotecas> Secuenciación> Análisis de información
De acuerdo con las reglas genéticas de la familia, seleccione uno o varios miembros centrales de la misma familia de enfermedades o muestras esporádicas, etc. El estudio debe tomar el tejido canceroso adyacente y el tejido normal del paciente como controles.
Para garantizar la calidad de la secuenciación, el ADN debe pasar una inspección de calidad antes de poder llevar a cabo operaciones posteriores. Las muestras de ADN deben detectarse mediante electroforesis como una sola banda, sin degradación evidente ni. Contaminación de ARN y proteínas, y requisitos de concentración y cantidad total:
Pureza del volumen de concentración de la muestra (A260/280) Cantidad total
ADN >50 ng/μL > 40 μl >1,7 >. Se procesaron enzimáticamente 2,0 µg
de ADN. Después del procesamiento, los fragmentos se dividieron en pequeños fragmentos de 200 - 300 pb y se utilizó Agilent SureSelect para capturar fragmentos de ADN de la región del exón para la secuenciación.
El ADN se descompone mediante un tratamiento enzimático. . fragmentos pequeños de pb, después de la reparación del extremo y la ligadura del adaptador, se construye una biblioteca de secuenciación después de que la biblioteca se desnaturaliza en ADN monocatenario, se agrega una sonda marcada con biotina complementaria a la región objetivo para la renaturalización de doble cadena y se agrega estreptomicina; Perlas magnéticas marcadas, mezclar para unir biotina y estreptoavidina; agregar campo magnético para enriquecer el complejo 'perlas magnéticas-estreptavidina-biotina-sonda-región objetivo', eliminar el campo magnético y luego eluir. Se utilizan perlas magnéticas para recolectar los fragmentos de ADN capturados. para secuenciación
Los fragmentos de ADN capturados se secuencian en Illumina. La profundidad de secuenciación recomendada es 100X o más. Si es para investigación de tumores, se requiere una profundidad mayor.
Cosas que la bioinformática puede analizar
Longitud de lectura de secuenciación: PE150
Profundidad: 100X
Volumen de datos: 10G
Ciclo:
(Enfermedad de un solo gen)
Uso de la secuenciación del exoma para analizar los trastornos del desarrollo de los óvulos
Los humanos estamos compuestos de óvulos maduros y espermatozoides. Se desarrolla a partir de óvulos fertilizados. Una vez que una mujer no puede producir óvulos maduros, no podrá producir descendencia. El mecanismo genético que bloquea la maduración de los óvulos aún no está claro. Para comprender las causas de los trastornos del desarrollo de los óvulos, se seleccionaron 3 muestras de casos y 2 muestras de control para la secuenciación del exoma completo de una gran familia de cuarta generación. Las mutaciones obtenidas mediante secuenciación se analizan en busca de mutaciones portadas por pacientes pero no portadas por personas normales, y la frecuencia de este sitio en 1000 Genomes, NHLBI y ExAC es inferior al 0,1%. Finalmente, se encontró una mutación c.686T>C p.V229A en el gen TUBB8. Se realizó la secuenciación de Sanger en las familias II-4, II-5 y III-5 para verificar este locus y se encontró que la mutación del paciente fue heredada de su padre. Posteriormente, se seleccionaron otras seis familias para la verificación del gen y todas tenían mutaciones TUBB8. Se llevaron a cabo experimentos de función celular relacionados con este gen y los resultados encontraron que el gen TUBB8 solo se distribuye en óvulos y embriones tempranos, y está relacionado con la formación de mutaciones de β-tubulina que afectan la formación de husos; lo que lleva a trastornos del desarrollo de los óvulos.
(Enfermedad compleja)
La secuenciación del exoma excava loci relacionados con el gen de resistencia al factor de coagulación de la hemofilia
Métodos de tratamiento tradicionales para la hemofilia A El sangrado ocasional se controla mediante la inyección de factor de coagulación VIII (FVIII) 2-3 veces por semana, pero alrededor del 30% de los pacientes con hemofilia desarrollarán anticuerpos contra este factor de coagulación, lo que hará que esta terapia sea ineficaz. Esta resistencia se debe a la sinergia de múltiples factores como el medio ambiente y la genética. Para descubrir nuevos loci relacionados con el gen de resistencia al factor de coagulación de la hemofilia, se realizó una secuenciación del exoma completo en 26 pacientes italianos con hemofilia (17 portadores de anticuerpos y 9 no portadores de anticuerpos). Después del filtrado de control de calidad de los sitios obtenidos mediante secuenciación, primero nos centramos en mutaciones dañinas raras relacionadas con genes reguladores inmunológicos; se utilizaron la prueba de Chi-cuadrado (Cochran-Armitage) y la prueba exacta de Fisher (exacta de Fisher) para realizar la correlación de casos y controles. Se mapearon 1364 sitios significativos (P <0,05) y se filtraron 28 mutaciones dañinas de estos sitios. Se amplió el tamaño de la muestra (53 pacientes con anticuerpos F VIII positivos y 174 pacientes con anticuerpos negativos) y se utilizó la tecnología de tipificación y mapeo TaqMan para verificar estos 28 sitios variantes. Los resultados mostraron que la mutación sin sentido rs3754689 se asoció significativamente con la coagulación de la hemofilia. Relacionado con resistencia al factor (OR 0,58; IC del 95 %: 0,36-0,94; P = 0,028)
(Tumor)
La combinación de la secuenciación del exoma completo y la tecnología de secuenciación de la región objetivo ayuda a los síndromes mielodisplásicos.
Los síndromes mielodisplásicos (MDS) son una anomalía heterogénea de las células madre hematopoyéticas caracterizada por anomalías hematopoyéticas y citopenias en sangre periférica. Hasta el 30% de las personas con síndrome mielodisplásico desarrollan leucemia mieloide aguda (LMA). Para revelar el mecanismo molecular de esta transformación, se tomaron muestras de 3 pacientes con SMD para analizar el exoma completo para obtener mutaciones somáticas. Después del filtrado, se obtuvieron 26 genes clave, incluidos los genes ROBO1 y ROBO2. Después de ampliar el tamaño de la muestra, se realizó una secuenciación de la región objetivo de alta profundidad en estos 26 genes y se encontró que 26 pacientes (12,4%) entre las 209 muestras portaban mutaciones ROBO1 y ROBO2 y se realizó heterocigosidad en la región ROBO; pacientes en diferentes etapas El análisis de pérdida de sexo (LOH) mostró que la frecuencia de CNV/LOH en pacientes de alto riesgo (50%, 7/14) era mayor que en pacientes de bajo riesgo (14,3%, 2/14). ).
Los experimentos in vitro han demostrado que la sobreexpresión de los genes ROBO1 o ROBO2 puede controlar el crecimiento de las células cancerosas, y la inactivación de la señalización ROBO/SLIT2 causada por mutaciones en ROBO1 o ROBO2 puede promover la progresión de la enfermedad.