¿Cuáles son las precauciones para la inmunohistoquímica?
1. La pérdida del antígeno depende principalmente de la frescura de las secciones de tejido. Generalmente, si las rodajas se almacenan a temperatura ambiente durante más de 3 a 6 meses, los antígenos de las rodajas pueden perderse gravemente. En este momento, se puede verificar aún más reutilizando bloques de parafina para seccionar (los bloques de parafina deben almacenarse a baja temperatura).
2. Durante la preparación de secciones de parafina, los grupos aldehídos pueden bloquear los determinantes antigénicos, que deben quedar completamente expuestos mediante la reparación del antígeno para aumentar la reacción de unión antígeno-anticuerpo y aumentar la tasa de positividad. Generalmente se utiliza la recuperación de antígenos por microondas, calor medio durante 6 minutos*4 veces y tampón de citrato de sodio.
3. Preste atención para comprobar si hay selecciones de anticuerpos incorrectas y condiciones de incubación de anticuerpos inapropiadas.
4. Los anticuerpos monoclonales antiselectivos tienen baja sensibilidad pero buena especificidad y son propensos a resultados negativos. Es un error común no detectar el tipo de tejido en la clasificación de la reactividad primaria del anticuerpo; Pueden producirse resultados negativos cuando el anticuerpo se selecciona para rata y el anticuerpo secundario es anti-ratón/conejo.
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5. El tiempo de incubación del anticuerpo es demasiado corto, lo que puede afectar fácilmente. conduce a resultados negativos. Generalmente, recomiendo incubar a 4°C durante la noche y recalentar a 37°C durante 30 minutos. No me gusta leer las instrucciones del kit de tinción de anticuerpos secundarios.
6. La concentración de anticuerpos es demasiado baja. Esta es la causa más probable de resultados negativos. La dilución debe aumentarse con la concentración baja y alta recomendada en las instrucciones por primera vez, y luego decido si aumentarla. o inferior.
Generalmente, primero se determina la concentración del anticuerpo secundario (la solución de trabajo es fácil de manejar y se puede agregar directamente) y se explora principalmente la concentración óptima del anticuerpo primario. Hay efectos previos y posteriores a las bandas en la reacción inmune. Cuanto mayor es la concentración, mayor es la tasa positiva y viceversa 7. El tiempo de bloqueo del suero también se puede acortar en consecuencia, pero este tiempo se puede ajustar. El propósito del sellado es reducir la coloración general del fondo.
8. No se puede ignorar la permeabilidad celular. Muchos camaradas creen que la permeabilidad celular generalmente no es necesaria para las secciones de parafina porque las células pueden haber sido seccionadas. proteínas nucleares, se recomienda la permeabilidad, para promover que los anticuerpos y otros reactivos participen plenamente en la reacción.
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Datos ampliados:
1. Clasificación de la inmunohistoquímica:
1. Tecnología de citoquímica de inmunofluorescencia: utilizando fluoresceína como sonda. Etiquetar anticuerpos conocidos, examinar células o tejidos en busca de los antígenos correspondientes. y observarlos bajo un microscopio de fluorescencia. Cuando la fluoresceína del complejo antígeno-anticuerpo se irradia con luz de excitación, emitirá fluorescencia de una determinada longitud de onda, de modo que se pueda determinar la ubicación o cuantificación del antígeno en el tejido.
2. Tecnología de citoquímica de inmunoenzimas: Es la tecnología más utilizada en la investigación de inmunohistoquímica. El principio básico es que el anticuerpo marcado con enzima primero reacciona con el tejido o las células, y luego se agrega el sustrato enzimático para generar un producto o partículas insolubles coloreados con una cierta densidad electrónica. Se localiza el antígeno correspondiente en las células o tejidos. detectado mediante un microscopio óptico o un microscopio electrónico.
3. Tecnología de oro inmunocoloidal: los anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios u otras moléculas marcadas con oro coloidal que pueden unirse específicamente a las inmunoglobulinas (como la proteína A de Staphylococcus) se utilizan como sondas para apuntar a tejidos o células. Realizar investigaciones cualitativas, de localización o cuantitativas sobre los antígenos que contienen. Debido a su alta densidad electrónica, el oro coloidal se utiliza a menudo para la localización de etiquetas únicas o múltiples en microscopía inmunoelectrónica.
2. Principios de la inmunohistoquímica:
La unión entre anticuerpos y antígenos es muy específica y la inmunohistoquímica aprovecha este principio. Primero, se extraen sustancias químicas de los tejidos o células como antígenos o haptenos, y luego se obtienen anticuerpos específicos mediante la inmunización de animales, y luego los anticuerpos se utilizan para detectar sustancias antigénicas similares en tejidos o células.
Dado que el complejo de antígeno y anticuerpo es incoloro, es necesario utilizar métodos histoquímicos para visualizar los sitios de unión del antígeno y el anticuerpo para lograr la caracterización, localización o cuantificación de antígenos desconocidos en tejidos o células. .
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