¿Qué es la proteómica?
Actualmente, la investigación sobre la función de las proteínas es extremadamente escasa. Se desconocen las funciones de la mayoría de las proteínas codificadas por genes recién descubiertos mediante la secuenciación del genoma, y para aquellas proteínas cuyas funciones se conocen, sus funciones se infieren principalmente a través de analogías con las funciones de genes homólogos. Se predice que al menos la mitad de las proteínas codificadas por el genoma humano tienen funciones desconocidas. Por lo tanto, en los próximos años, cuando se complete la secuenciación del genoma de al menos 30 especies, el enfoque de la investigación humana inevitablemente se desplazará hacia la función de las proteínas, y la investigación del proteoma puede lograr este objetivo. En la aplicación específica de la proteómica, el importante papel de las proteínas en las enfermedades hace que la proteómica sea extremadamente valiosa en el estudio de las enfermedades humanas.
La enfermedad puede ser causada por solo un cambio de un par de bases en el genoma, como el cambio de Glu en la posición 6 de la beta-hemoglobina a Val, lo que lleva a la anemia de células falciformes. Sin embargo, para la mayoría de las enfermedades, la patogénesis es mucho más compleja. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares del desarrollo de enfermedades requiere métodos para abordar estas complejidades. Como macromoléculas activas en las células, las proteínas son sin duda las principales moléculas relacionadas con las enfermedades. Los cambios en los niveles de expresión de las proteínas están directamente relacionados con enfermedades, fármacos o toxinas. Por tanto, la proteómica basada en el nivel general de proteínas desempeñará sin duda un papel importante en el estudio de las enfermedades humanas.
Actualmente, la aplicación de la proteómica en enfermedades humanas se ha llevado a cabo ampliamente en algunas enfermedades, como enfermedades de la piel, cáncer y enfermedades cardíacas. Estos estudios se centran principalmente en los siguientes aspectos: Búsqueda de enfermedades individuales. las proteínas, en su conjunto, estudian cambios en la expresión o modificación de proteínas causadas por enfermedades, y utilizan el proteoma para encontrar marcadores de diagnóstico y vacunas para enfermedades causadas por microorganismos patógenos. A continuación, presentamos las técnicas básicas de la proteómica y sus aplicaciones en estos campos.
Tecnología básica para la investigación en proteómica
Para la investigación en proteómica, el método experimental más básico es utilizar electroforesis de proteínas bidimensional (2DE) para detectar la expresión de proteínas a nivel del genoma completo. La electroforesis en gel bidimensional utiliza primero el enfoque de puntos isoeléctricos para separar proteínas con diferentes puntos isoeléctricos y luego utiliza SDS-PAGE para separar proteínas de diferentes pesos moleculares con una resolución muy alta. Las proteínas en el rango de los microgramos se pueden distinguir muy bien. Por ejemplo, a nivel de microgramos, alguien ha aislado hasta 11.200 proteínas de una mezcla de proteínas, lo cual es un número impresionante. Por lo tanto, la electroforesis en gel bidimensional de proteínas a escala de microgramos se utiliza a menudo para la detección preliminar de proteínas con expresión alterada o modificada. Luego, la misma muestra de mezcla de proteínas se puede usar en 2DE a escala de miligramos, de modo que cada péptido en el espectro de electroforesis se pueda purificar y analizar más a fondo, como espectrometría de masas, análisis de secuencia de aminoácidos terminales o intermedios, etc.
Obviamente, realizar una electroforesis en gel bidimensional no es suficiente, porque los cambios en la expresión de proteínas obtenidos mediante electroforesis en gel bidimensional no pueden vincularse a cambios específicos en la expresión de proteínas. Sin embargo, algunas técnicas tradicionales, como la transferencia Western o la transferencia por afinidad de lectinas, no son útiles con esta información. Para identificar estas proteínas obtenidas por electroforesis, la espectrometría de masas (MS) se utiliza ampliamente en proteómica. Para la identificación de proteínas, se utilizan ampliamente dos métodos, a saber, MALDI-MS (separación por láser asistida por matriz) y ESI-MS (ionización por electropulverización). Cada uno de estos dos métodos tiene su propio ámbito de aplicación. Generalmente, el primero es más eficaz para analizar proteínas de alto peso molecular, mientras que el segundo es más sensible para detectar claras de huevo, que a menudo pueden alcanzar niveles inferiores a Fick. La espectrometría de masas se puede utilizar para el análisis de proteínas principalmente porque puede proporcionar información estructural diferente de una proteína específica. Por ejemplo, puede determinar directamente la información del peso molecular de una proteína o polipéptido y también se puede utilizar para obtener información sobre la secuencia de proteínas. Al mismo tiempo, la espectrometría de masas también puede obtener algunos datos sobre modificaciones postraduccionales, como el tipo de azúcar y la fosforilación, cambiando el peso molecular de los fragmentos de polipéptidos. Por lo tanto, la espectrometría de masas es muy importante para la identificación de proteínas y su progreso, sin duda, promoverá en gran medida el progreso de la investigación en proteómica.
Búsqueda de una única proteína relacionada con la enfermedad
Durante el proceso de la enfermedad, el tipo y la cantidad de proteínas a menudo cambian debido a cambios en la información genética relacionada con la enfermedad, y estos cambios pueden ser a través de alta Detectado mediante electroforesis en gel bidimensional de alta resolución, que es la base para utilizar la proteómica para encontrar e identificar proteínas relacionadas con enfermedades.
La aparición del cáncer de colon es un proceso de varios pasos que implica múltiples mutaciones genéticas, incluida la pérdida de función de los genes supresores de tumores y la activación de oncogenes. Sin embargo, los mecanismos específicos de la tumorigénesis aún no están claros. Para una enfermedad de este tipo que involucra múltiples proteínas, la gente ha comenzado a utilizar la proteómica para analizar los cambios en los polipéptidos después de la transformación maligna de la mucosa del colon. En comparación con 15 pacientes con cáncer de colon y 13 personas normales, los resultados de la electroforesis en gel bidimensional mostraron que había 882 puntos y 861 puntos respectivamente, entre estos puntos había una proteína con un peso molecular de 13 kDa y un punto isoeléctrico de 5,6. que solo se encontró en tejido tumoral con expresión específica. Entre 15 muestras de cáncer, 13 casos tuvieron una regulación positiva, lo que representa el 87 %. Otros estudios también confirmaron que existen diferencias significativas en los niveles de expresión de esta proteína en diferentes grados de anomalías del desarrollo causadas por el cáncer. ¿Qué es esta proteína encontrada por electroforesis bidimensional que puede estar relacionada con el cáncer? Después de la hidrólisis de tripsina, el péptido se separó mediante μ-HPLC y se secuenció. La secuenciación produjo dos secuencias, LGHPDTLNQ y VIEHMEDLDTNADK, que eran completamente consistentes con las de cadherina B. Un análisis adicional mediante MALDI-MS también confirmó que la proteína era cadherina B. Al mismo tiempo, combinado con hallazgos anteriores, estaba compuesta de cadherina B. y a El contenido de la proteína heterodimérica caldefensa en las muestras de heces de pacientes con tumores gastrointestinales ha mejorado enormemente. La alta especificidad de la cadherina B en los tejidos tumorales indica que desempeña un papel importante en la aparición del cáncer de colon. Aunque la función específica de la proteína aún no se ha aclarado más, este ejemplo ha demostrado que encontrar proteínas relacionadas con enfermedades mediante la proteómica es ciertamente factible.
Otro ejemplo es la investigación sobre el carcinoma hepatocelular. La electroforesis en gel bidimensional (2-DE) se ha utilizado con éxito para buscar proteínas asociadas con el cáncer de hígado en ratones inducidos químicamente. La aplicación combinada de electroforesis bidimensional y métodos de química de proteínas proporciona una comprensión más profunda de la especificidad de estas proteínas relacionadas con el cáncer. Después de que la N-metil-N-nitrosourea indujera cáncer de hígado en ratones, la electroforesis bidimensional encontró algunas proteínas cuya expresión cambió. Después del análisis de la secuencia de aminoácidos, una de las proteínas era una proteína similar a la aldosa reductasa derivada del cáncer de hígado. El peso molecular de esta proteína es de 35 KDa y su punto isoeléctrico es de 7,4. Es una proteína expresada específicamente en el cáncer de hígado y en el hígado embrionario. Después de obtener una proteína que pueda estar relacionada con el cáncer mediante electroforesis bidimensional, se pueden utilizar algunos métodos de química de proteínas para estudiar más a fondo la correlación de esta proteína con la enfermedad. Mediante inmunohistoquímica, se descubrió que el anticuerpo FR-1 dirigido contra la proteína similar a la aldosa reductasa del cáncer de hígado mostró que esta proteína se expresaba fuertemente en las etapas tempranas y tempranas de la transformación tumoral en ratones con cáncer de hígado inducido químicamente, pero no se expresaba. en el tejido hepático normal. Esta es una fuerte evidencia de que esta proteína está involucrada en el proceso del cáncer de hígado.
Algunos estudios sobre esta proteína han demostrado que la aldosa reductasa es un miembro de la superfamilia de las reductasas. Puede catalizar la conversión de glucosa en sorbitol en la vía del sorbitol. También participa en algunas complicaciones de la diabetes. un papel en la aparición de la enfermedad. Como enzima, puede hidrolizar algunas sustancias biológicamente heterogéneas, por lo que también participa en algunos procesos de desintoxicación. Es un hecho bien establecido que durante la carcinogénesis hepática aumentan los niveles de expresión o actividades de algunas enzimas desintoxicantes. Para la aldosa reductasa, una proteína con función de desintoxicación, sólo la proteína similar a la aldosa reductasa del cáncer de hígado encontrada mediante electroforesis bidimensional está relacionada con el cáncer de hígado. Se expresa por primera vez en el hígado embrionario pero no en el hígado adulto. Se reexpresa cuando se produce cáncer de hígado. Por lo tanto, se puede inferir preliminarmente que la proteína similar a la aldosa reductasa está relacionada con el proceso de desintoxicación del hígado durante la aparición del carcinoma hepatocelular. Ahora, la proteína homóloga de la proteína similar a la aldosa reductasa de ratón también se ha encontrado en el cáncer de hígado humano y también se expresa selectivamente en diferentes tejidos de humanos.
Investigación general sobre proteínas relacionadas con enfermedades
Para la mayoría de las enfermedades, la enfermedad a menudo causa cambios en más de una proteína o en varias proteínas, y la cantidad de proteínas involucradas en el proceso de la enfermedad es también muy grande. Por lo tanto, además de encontrar proteínas individuales asociadas con enfermedades mediante electroforesis en gel bidimensional, también es importante estudiar proteínas con expresión alterada a nivel general a través del proteoma. La miocardiopatía dilatada (MCD) es un buen ejemplo de los estudios actuales de electroforesis en gel bidimensional de proteínas de nivel completo.
La miocardiopatía dilatada es una enfermedad cardíaca grave. Se desconoce la patogénesis de esta enfermedad y las moléculas involucradas, y es poco probable que una enfermedad tan compleja sea causada por un solo mecanismo patogénico. Por lo tanto, es extremadamente necesario estudiar estas enfermedades desde el nivel general del proteoma. Además, el corazón, que se compone principalmente de cardiomiocitos, es un tejido relativamente homogéneo en comparación con otros tejidos, lo que también proporciona una buena base para estudiar grupos de proteínas mediante electroforesis en gel bidimensional. La investigación sobre el proteoma DCM comenzó a principios de los años 1990. Actualmente, se ha establecido una base de datos de electroforesis en gel bidimensional de miocardio. Aunque existen diferencias en los datos entre laboratorios de todo el mundo, como diferentes preparaciones de muestras, diferentes condiciones de enfoque isoeléctrico, diferentes tamaños de gel, etc., la comparación de estos datos demuestra que, en la mayoría de los casos, las posiciones de diferentes proteínas son relativamente estables, un Se puede hacer una amplia gama de comparaciones.
En el estudio de Knecht et al., se obtuvieron resultados de electroforesis bidimensional de alta resolución de aproximadamente 3300 manchas de proteínas cardíacas, y se identificaron 150 mediante análisis de aminoácidos, degradación de Edman N-terminal e intermedia, y la proteína MALDI-MS, compararon los resultados de 2-DE de cientos de pacientes con miocardiopatía normal y dilatada, y encontraron que las bandas de proteínas de los dos eran comparables. Además de los cambios en el número y la intensidad de las manchas que no se repiten que pueden ser causados por diferentes parámetros relacionados con la enfermedad, como la gravedad de la enfermedad, el uso de medicamentos, la edad del paciente, etc., hay 25 proteínas que son estadísticamente significativas entre pacientes y gente normal. Estas son proteínas relacionadas con DCM. Este resultado se basa en un estudio a gran escala de cientos de muestras. Sólo los estudios a gran escala pueden reflejar el valor de este resultado en perspectivas de aplicación práctica. Para estas docenas de proteínas relacionadas con enfermedades, podemos utilizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, la medición de la actividad enzimática, etc. , para identificarlos mejor y confirmar su relevancia para la enfermedad y su papel en la misma. Estos trabajos se basan en estudios de proteomas. Evidentemente, es sin duda la forma más básica y eficaz de realizar un estudio general a gran escala de proteínas relacionadas con enfermedades en cientos de muestras de pacientes con MCD y controles normales.
Análisis proteómico de microorganismos patógenos.
En los últimos años, el estudio de las enfermedades infecciosas ha cobrado más importancia que nunca. La aparición de algunos nuevos patógenos infecciosos, como Borrelia burgdorferi, VIH, virus del Ébola, etc. , añadiendo algunas enfermedades que originalmente se pensaba que estaban bajo control, como la tuberculosis y las infecciones estreptocócicas multirresistentes. Por tanto, es muy necesario utilizar la proteómica para analizar microorganismos y virus virulentos. Puede utilizarse para descubrir y estudiar factores de virulencia, antígenos, vacunas, etc., lo cual es de suma importancia para el diagnóstico, tratamiento y prevención de enfermedades. En la actualidad, se ha completado la secuenciación del genoma de 18 microorganismos y se está realizando la secuenciación del genoma de más de 60 microorganismos. La información de estas secuencias de genes y el número mucho menor de genes que en los tejidos eucariotas proporcionan una buena base para el estudio de los proteomas.
Borrelia burgdorferi del género Borrelia es el principal agente causante de la enfermedad de Lyme en humanos. Al principio, los síntomas de la enfermedad tienden a aparecer como erupciones similares a eritema anular y síntomas similares a los de la gripe, y luego pueden causar algunas complicaciones neurológicas y artritis. En la actualidad, el diagnóstico de esta enfermedad se basa principalmente en los síntomas clínicos, complementados con experimentos serológicos como ELISA y Western blot. Debido a que estas pruebas tienen distintos grados de sensibilidad y especificidad, el diagnóstico no está estandarizado. Es particularmente necesario utilizar la investigación proteómica para proporcionar algunos marcadores de diagnóstico nuevos y más estándar.
El cromosoma de Borrelia burgdorferi tiene 853 genes, y sus 11 plásmidos tienen 430 genes adicionales. Su patrón de electroforesis en gel bidimensional tiene alrededor de 300 puntos, a partir de los cuales se pueden encontrar proteínas como anticuerpos relacionados con el sistema inmunológico. Después de numerar 217 puntos en un gel 2DE teñido con plata de Borrelia burgdorferi, se identificó mediante inmunohibridación con anticuerpos policlonales de conejo la ubicación de algunos antígenos en el gel, como la proteína A de la superficie exterior (OspA), OspB,. /100, p39, flagelina p41, etc. Con excepción de p83/100, todos los antígenos están presentes en más de un punto del gráfico 2D. Para el análisis de transferencia se utilizaron perfiles 2DE de sueros de pacientes con borreliosis de Lyme con diferentes síntomas y especies de Borrelia. Se encontró que el suero de 10 pacientes con síntomas de eritema migratorio contenía anticuerpos IgM y anticuerpos IgG de 60 y 88 antígenos respectivamente, mientras que el suero de pacientes con artritis contenía anticuerpos IgM de 15 antígenos y anticuerpos IgG de 76 antígenos diferentes.
El suero de pacientes con neurospirosis avanzada contenía 33 anticuerpos IgM y 76 anticuerpos IgG, pero el suero de pacientes con estas tres enfermedades diferentes contenía anticuerpos contra estos antígenos, como OspA, OspB, OspC, flagelina y p83/100, p39. etc. , que también fue el marcador utilizado para el diagnóstico en los experimentos serológicos iniciales. Los resultados del proteoma verificaron la racionalidad del diagnóstico original. Al mismo tiempo, los resultados de la 2DE también descubrieron algunos antígenos no descubiertos anteriormente, que son solo algunos nuevos marcadores de diagnóstico potenciales. El descubrimiento de más marcadores de diagnóstico será de gran ayuda para la estandarización y precisión del diagnóstico.
Toxoplasma gondii es causado por la infección parasitaria del protozoo Toxoplasma gondii. Alrededor del 30% de las personas en todo el mundo son portadoras de este parásito y en Europa la toxoplasmosis es una de las enfermedades infecciosas más comunes, por lo que el daño de esta enfermedad es bastante alto. En personas sanas, las infecciones parasitarias suelen ser asintomáticas o extremadamente leves, pero si se infectan durante el embarazo, los parásitos pueden atravesar la placenta y provocar la muerte fetal. A medida que avanza el embarazo, aumenta la probabilidad de infiltración parasitaria. Por tanto, es importante determinar el momento de la infección. Por otro lado, las consecuencias de la infección en las diferentes etapas del embarazo también son diferentes. Al principio del embarazo, las infecciones durante la organogénesis pueden ser fatales, mientras que más adelante en el embarazo, las infecciones fetales a menudo provocan complicaciones como anomalías de la pigmentación de la retina. Si las mujeres infectadas durante el embarazo reciben el tratamiento adecuado, la probabilidad de infección fetal y la gravedad de sus consecuencias se reducirán considerablemente. Por lo tanto, el diagnóstico oportuno y el juicio preciso del momento de la infección son cruciales para el tratamiento de la toxoplasmosis.
Pero, de hecho, más del 90% de las mujeres embarazadas no pueden detectar a tiempo su primera infección. En la actualidad, el diagnóstico se basa principalmente en métodos serológicos y métodos de PCR, pero para algunos pacientes no inmunes y embarazadas, los métodos serológicos para detectar anticuerpos obviamente no son suficientes, y la infección latente a menudo ocurre en personas sin respuesta inmune. Por ejemplo, entre los pacientes con SIDA, Toxoplasma gondii es una de las principales causas de lesiones cerebrales y muerte. A partir de esto, se puede ver que el diagnóstico eficaz de la enfermedad es muy crítico para un tratamiento eficaz. Asimismo, los estudios a nivel de proteoma proporcionan un enfoque muy potente para este avance. Podemos utilizar los sueros de pacientes con diferentes estados de infección y el patrón de electroforesis bidimensional de Toxoplasma gondii para realizar inmunotransferencia y encontrar antígenos relacionados con la infección como marcadores de diagnóstico. Estos sueros diferentes incluyen: sueros de mujeres embarazadas con toxoplasmosis aguda, sueros de pacientes no embarazadas con toxoplasmosis aguda y sueros de pacientes que aún no han desarrollado toxoplasmosis latente. Los resultados mostraron que 9 puntos en el mapa 2DE pueden reaccionar con cualquier tipo de inmunoglobulina en el suero infectado y esta reacción es independiente del estado y la incidencia de la infección. Por lo tanto, estos 9 puntos pueden usarse como marcadores de infección por Toxoplasma gondii. Además, los siete puntos de acupuntura y la respuesta de anticuerpos están relacionados con el tipo o la incidencia de anticuerpos, que pueden usarse para distinguir diferentes condiciones como el período de incubación y la fase aguda, y también pueden usarse como marcador de diagnóstico para determinar aún más la infección. estado.
Resumen
La electroforesis en gel bidimensional es como un microscopio molecular que separa mezclas complejas de proteínas. Al comparar más enfermedades y controles, se pueden descubrir algunas proteínas relacionadas con enfermedades. Actualmente, el área de proteómica más utilizada es la búsqueda de proteínas únicas relacionadas con enfermedades comparando bandas 2DE de enfermedad y controles. La regulación positiva de la cadherina B en el cáncer de colon y la reexpresión de la proteína similar a la aldosa reductasa en el cáncer de hígado de ratón son dos ejemplos típicos. La relación entre estas proteínas y la enfermedad se puede determinar mejor mediante inmunohistoquímica y otros métodos. Por otro lado, también es fundamental realizar investigaciones a nivel general utilizando proteomas. Por ejemplo, los estudios sobre miocardiopatía dilatada han demostrado diferencias significativas en 25 proteínas entre pacientes y controles, y se ha establecido una base de datos de electroforesis en gel bidimensional de miocardio humano que incluye 3300 proteínas. Para el nivel general de investigación, cuanto mayor sea la escala y más muestras se utilicen, más profundo podrá ser el estudio de los mecanismos moleculares, por lo que la cooperación internacional es muy importante. Otro campo de aplicación de la proteómica es la búsqueda de proteínas diagnósticas de microorganismos patógenos como Borrelia burgdorferi Borrelia burgdorferi Borrelia burgdorferi Borrelia burgdorferi Borrelia burgdorferi Borrelia burgdorferi, Toxoplasma gondii, etc. Los marcadores de diagnóstico derivados de la proteómica pueden incluso usarse para diferenciar entre diferentes etapas de la enfermedad, proporcionando una base para desarrollar diagnósticos y pruebas eficaces. El estudio de la proteómica nos ha abierto un nuevo campo para estudiar la función de las proteínas y las enfermedades humanas. Aunque todavía está en su infancia y es necesario perfeccionar y desarrollar muchas tecnologías, no se puede subestimar su potencial.
En el futuro, la aplicación de la proteómica en enfermedades humanas será más amplia y profunda.