¿Qué son las pruebas de desensibilización?
Introducción a las pruebas de susceptibilidad a medicamentos
Los antibióticos juegan un papel muy importante en el control de enfermedades infecciosas bacterianas. Sin embargo, debido al uso indebido y poco científico de los antibióticos durante el proceso de reproducción, muchas bacterias patógenas han desarrollado resistencia a los antibióticos, lo que hace que los antibióticos sean cada vez menos eficaces en la prevención y el tratamiento de enfermedades bacterianas. Esto no sólo provoca un desperdicio de medicamentos, sino también retrasos. La enfermedad, provocando graves consecuencias a los agricultores, provocó grandes pérdidas económicas. Con la aparición de nuevas bacterias patógenas, la eficacia de los fármacos antibacterianos es cada vez peor. Además, varias bacterias patógenas tienen diferentes sensibilidades a diferentes fármacos antibacterianos, y diferentes cepas de la misma bacteria también tienen diferentes sensibilidades a diferentes fármacos antibacterianos. Durante mucho tiempo, la aparición de resistencia a los medicamentos de varias bacterias patógenas a menudo hace que varios medicamentos antibacterianos de uso común pierdan su eficacia y no se puede comprender bien la sensibilidad de los medicamentos a las bacterias. Por lo tanto, los médicos pueden utilizar un resultado correcto para seleccionar el antibacteriano. medicamentos y mejorar la referencia de eficacia. Esto requiere el uso de pruebas de susceptibilidad a los medicamentos para determinar la sensibilidad a los medicamentos de modo que los medicamentos puedan usarse de manera precisa y efectiva para el tratamiento. Sin embargo, debido a los estrictos requisitos y las altas condiciones para las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos, solo se pueden realizar en colegios y universidades o unidades de investigación científica. Es difícil para algunas plantas de cultivo o algunas clínicas ambulatorias realizar pruebas de susceptibilidad a los medicamentos. Para resolver este problema, después de varios años de resumen y práctica, el Centro de Tratamiento y Diagnóstico de Enfermedades Animales de Qingdao Yibang Bioengineering Co., Ltd., Instituto de Cuarentena Animal del Ministerio de Agricultura, ha resumido gradualmente varios conjuntos de métodos operativos adecuados. para las pruebas de sensibilidad a las drogas de base. Se presentan brevemente a continuación.
[Editar este párrafo] Clasificación de las pruebas de susceptibilidad a medicamentos
Los métodos actuales de prueba de susceptibilidad a medicamentos en los laboratorios de microbiología clínica incluyen principalmente el método de difusión en disco y el método de dilución (incluido el método de dilución en agar y caldo) , método de gradiente de concentración de antibióticos (método de prueba E), instrumentos automatizados, etc.
1. Método de difusión en papel
Este método consiste en pegar un trozo de papel de filtro que contiene una cantidad cuantitativa de fármacos antibacterianos sobre la superficie de agar inoculado con las bacterias de prueba y los fármacos contenidos. el papel se difunde en el agar. A medida que aumenta la distancia de difusión, la concentración del agente antimicrobiano disminuye logarítmicamente, creando un gradiente de concentración alrededor del papel. Al mismo tiempo, las cepas dentro del rango de concentración inhibidora alrededor del papel no pueden crecer, y las cepas fuera del segundo rango inhibidor pueden crecer, formando así una zona inhibidora transparente alrededor del papel. El diámetro de la zona de inhibición de diferentes fármacos bacteriostáticos puede variar según la velocidad de difusión del fármaco en agar. El tamaño de la zona de inhibición puede reflejar la sensibilidad de las bacterias de prueba al fármaco y se correlaciona negativamente con la CIM del fármaco frente a las bacterias de prueba.
2. Método de dilución
La prueba de susceptibilidad por dilución se puede utilizar para detectar cuantitativamente la actividad in vitro de fármacos antibacterianos contra ciertas bacterias y se divide en método de dilución en agar y método de dilución en caldo. En los experimentos, la concentración de fármacos antibacterianos suele diluirse veces (lg2), y la concentración más baja del fármaco que puede provocar el crecimiento de las bacterias que se van a analizar se convierte en la concentración mínima inhibidora (CIM). El rango de concentración de la prueba para un fármaco antimicrobiano específico debe incluir la concentración a la cual se pueden detectar los puntos de inflexión interpretables (sensibilidad, intermediación y resistencia) de la bacteria, y también debe incluir la CIM. 2.1 El método de dilución en agar se utiliza para el control de calidad de las cepas de referencia. Primero, prepare placas de dilución de agar que contengan agentes antimicrobianos. Inocular con la cepa a ensayar e interpretar los resultados. 2.2 Método de dilución en caldo
3. Método del gradiente de concentración de antibióticos
4. Método de instrumento automático
Pasos experimentales
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Medio de cultivo de agar nutritivo común: se puede comprar en tiendas de reactivos bioquímicos. Se pueden seleccionar diferentes medios de cultivo para pruebas de susceptibilidad a medicamentos de diferentes bacterias. Por ejemplo, puede elegir agar nutritivo común o medio MacFuchs para realizar pruebas de susceptibilidad a medicamentos de E. coli. Se puede utilizar medio de cultivo de suero para Salmonella. Papel de prueba de susceptibilidad a las drogas: comprado o hecho en casa (consulte la preparación del experimento para obtener más detalles) Bacterias: Instrumentos bacterianos necesarios para la prueba de susceptibilidad a las drogas: asa de inoculación, lámpara de alcohol, punzón, vaso Oxford, pipeta, transmisor.
2. Preparación experimental
2.1 Preparación de tabletas sensibles a los medicamentos: compradas o caseras 2.1.1 Método de preparación: Tome papel de filtro cualitativo Xinhua 1 y perfórelo hasta obtener un diámetro de 6 mm. con un perforador Pequeños trozos de papel redondos. Tome 50 trozos de papel redondo y colóquelos en una botella de penicilina vacía, limpia y seca, y envuelva la boca de la botella con una sola capa de papel kraft. Después de esterilizar en autoclave a 15 libras de presión. 15-20 minutos y colocar en una incubadora o en un horno a 37°C durante varios días para que se seque por completo. 2.1.2 Preparación del papel antibacteriano: Agregue 0,25 ml de solución medicinal a un frasco de penicilina que contenga 50 trozos de papel y voltee los papeles para que cada trozo de papel quede completamente empapado con la solución medicinal. El papel no puede aplastarse al girarlo. Al mismo tiempo, escriba el nombre del medicamento en la boca del frasco, colóquelo en una incubadora a 37°C durante la noche, séquelo y luego cierre la tapa. Si es posible, secar al vacío.
No se humedezca, guárdelo en un lugar oscuro y seco, el período de validez es de 3 a 6 meses. 2.2 Preparación de líquido medicinal (para probar medicamentos disponibles comercialmente): Prepare el líquido medicinal de acuerdo con la proporción de dosis terapéutica de los medicamentos disponibles comercialmente, por ejemplo, el medicamento disponible comercialmente Bai Bingxiao se puede preparar de acuerdo con la cantidad prescrita de 0,01% de agua potable; Medicina líquida. Agregue 10 mg a 10 ml de agua y mezcle bien. Este diluyente se utiliza para pruebas de susceptibilidad a medicamentos.
3. Método de operación experimental
3.1 Método de tableta sensible a los medicamentos 3.1.1 En el "banco limpio", utilice un asa de inoculación esterilizada por una llama (lámpara de alcohol) para seleccionar una cantidad adecuada de bacterias Para el cultivo, utilice el método de rayado para esparcir las bacterias en el medio de cultivo de la placa de Petri. Método específico: utilice un asa de inoculación estéril para tomar una cantidad adecuada de bacterias y aplicarla en cuatro puntos del borde de la placa de Petri, y marcar las bacterias desde cada punto hasta la mitad de la placa de Petri. Luego, busque la segunda línea de puntos en la mitad del plato y dibuje líneas en secuencia hasta que las bacterias se distribuyan uniformemente en el plato. (Además, puede seleccionar las bacterias que se van a probar, hacer una suspensión bacteriana en una pequeña cantidad de solución salina fisiológica y utilizar un hisopo de algodón esterilizado para aplicar la suspensión bacteriana que se va a probar en la superficie del medio de cultivo en placa. El recubrimiento se requiere que sea uniforme y denso) 3.1.2 Extinción de la llama de la lámpara de alcohol Detenga las pinzas después de eliminar las bacterias, tome la tableta sensible a los medicamentos y péguela en la superficie del medio de cultivo en placa. Para que la tableta sensible a los medicamentos se adhiera estrechamente al medio de cultivo, puede usar unas pinzas para presionar suavemente la tableta sensible a los medicamentos. Para observar los resultados con precisión, es necesario que las tabletas sensibles a los medicamentos se puedan distribuir regularmente en el medio de cultivo de la placa. Generalmente, se puede pegar una pieza en el centro de la placa y algunas piezas a distancias iguales en la periferia; (Se pueden colocar siete piezas en la periferia). Recuerde el nombre de cada tableta sensible a los medicamentos. 3.1.3 Coloque el medio de cultivo de la placa de cultivo en una incubadora a 37 °C durante 24 horas y observe el efecto. 3.2 Copa Oxford 3.2.1 En el "banco limpio", use un asa de inoculación esterilizada con llama (lámpara de alcohol) para seleccionar una cantidad adecuada de cultivo bacteriano y use el método de rayado para esparcir las bacterias en el plato de cultivo. Método específico: utilice un asa de inoculación estéril para tomar una cantidad adecuada de bacterias y aplicarla en cuatro puntos del borde de la placa de Petri, y marcar las bacterias desde cada punto hasta la mitad de la placa de Petri. Luego, busque la segunda línea de puntos en la mitad del plato y dibuje líneas en secuencia hasta que las bacterias se distribuyan uniformemente en el plato. (Además, puede seleccionar las bacterias que se van a probar, hacer una suspensión bacteriana en una pequeña cantidad de solución salina fisiológica y utilizar un hisopo de algodón esterilizado para aplicar la suspensión bacteriana que se va a probar en la superficie del medio de cultivo en placa. El recubrimiento (se requiere que sea uniforme y denso.) 3.2.2 Retire las bacterias esterilizadas El tubo de acero inoxidable de las bacterias (un tubo redondo con un diámetro interior de 6 nm, un diámetro exterior de 8 nm y una altura de 65438 ± 00 nm , ambos extremos deben ser lisos, también se pueden usar tubos de vidrio y tubos de porcelana) se colocan en el medio de cultivo y se presionan suavemente para que no haya espacio de contacto con el medio de cultivo, y los nombres de varios medicamentos están marcados en el tubos delgados. Cada plato puede contener de 4 a 6 tubos pequeños. Después de esperar unos minutos, coloque una cierta cantidad de diversas soluciones medicinales en cada tubo de ensayo pequeño para evitar que se desborde. Incubar a 37°C durante 8-18 horas y observar los resultados. 3.2.3 Coloque el medio de cultivo de la placa de cultivo en una incubadora a 37 °C durante 24 horas y observe el efecto. 3.3 Método de perforación: este método es simple, de bajo costo, fácil de operar y adecuado para probar medicamentos comerciales. 3.3.1 En el "banco limpio", utilice un asa de inoculación esterilizada con llama (lámpara de alcohol) para seleccionar una cantidad adecuada de cultivo bacteriano y utilice el método de rayado para esparcir las bacterias en el medio de cultivo de la placa de Petri. Método específico: utilice un asa de inoculación estéril para tomar una cantidad adecuada de bacterias y aplicarla en cuatro puntos del borde de la placa de Petri, y marcar las bacterias desde cada punto hasta la mitad de la placa de Petri. Luego, busque la segunda línea de puntos en la mitad del plato y dibuje líneas en secuencia hasta que las bacterias se distribuyan uniformemente en el plato. (Además, puede seleccionar las bacterias que se van a probar, hacer una suspensión bacteriana en una pequeña cantidad de solución salina fisiológica y utilizar un hisopo de algodón esterilizado para aplicar la suspensión bacteriana que se va a probar en la superficie del medio de cultivo en placa. El recubrimiento Se requiere que sea uniforme y denso 3.3.2 Coloque el tubo de acero inoxidable (el diámetro exterior es de 4 mm, el diámetro del orificio y el espacio entre los orificios son de 3 mm y ambos extremos deben ser lisos (también se aceptan tubos de vidrio y tubos de porcelana). Después de la esterilización, colóquelo sobre el medio de cultivo para hacer un agujero. Use una aguja para sacar el medio de cultivo en el agujero y selle el fondo con una llama para que el medio de cultivo se integre completamente con la placa. goteando y afectando los resultados). 3.3.3 Agregue muestras según los diferentes líquidos hasta que la muestra se llene pero no se desborde. 3.3.4 Coloque el medio de cultivo del plato de cultivo a 37 °C. Observe el efecto después de 24 horas en la caja.
Observación de resultados
En la placa de agar recubierta con bacterias, el fármaco antibacteriano se difunde alrededor del agar y su concentración disminuye gradualmente, inhibiendo así los efectos alrededor del papel. bacterias dentro de una cierta distancia después del cultivo nocturno, se forma una zona de inhibición, cuanto mayor es la zona de inhibición, mayor es la sensibilidad de la cepa a este medicamento; de lo contrario, si no hay una zona de inhibición, significa que la cepa es sensible a; La resistencia de este fármaco está directamente relacionada con la concentración del fármaco y la concentración de bacterias rayadas.
Estándares
1. zona para determinar la sensibilidad.
Tabla 1 Diámetro de la zona de inhibición estándar de susceptibilidad (mm) determinado mediante prueba de susceptibilidad a medicamentos
Extremadamente sensible por encima de 20
15~20 Altamente sensible
10~ 14 sensibilidad del reloj
Baja sensibilidad inferior a 10
0 Insensible
2. Los estándares de la prueba de sensibilidad a los medicamentos se muestran en la Tabla 1. Se considera zona de inhibición de polimixina superior a 9 mm; altamente sensible, 6-9 mm se considera baja sensibilidad y ninguna zona de inhibición se considera insensible.
Factores que afectan los resultados de susceptibilidad a los medicamentos
1. Medio de cultivo: debe prepararse de acuerdo con las necesidades nutricionales de las bacterias de prueba. Al verter el tablero, el grosor debe ser adecuado (alrededor de 5-6 mm), pero no demasiado fino. Generalmente, es apropiado verter 18-20 ml de medio de cultivo en una placa de Petri con un diámetro de 90 mm. Deben evitarse en el medio de cultivo las sustancias antagonistas de los fármacos antibacterianos, como los iones de calcio y magnesio, que pueden reducir la actividad antibacteriana de los aminoglucósidos, mientras que la timidina y el ácido paraaminobenzoico (PABA) pueden antagonizar la actividad de las sulfonamidas y el TMP. 2. Volumen de inóculo bacteriano: el volumen de inóculo bacteriano debe ser constante. Si hay demasiada, la zona de inhibición se hará más pequeña y las cepas productoras de enzimas destruirán la actividad antibacteriana del fármaco. 3. Concentración del fármaco: la concentración y la cantidad total del fármaco afectan directamente los resultados de la prueba antibacteriana y requieren una preparación precisa. Los medicamentos disponibles comercialmente deben formularse estrictamente de acuerdo con las dosis terapéuticas recomendadas. 4. Tiempo de cultivo: la temperatura y el tiempo de cultivo general es de 37 °C durante 8 a 18 horas. Algunos fármacos antibacterianos como la polimixina se difunden lentamente. El medio de cultivo en placa que contiene medicamentos antibacterianos se puede colocar en un refrigerador a 4°C durante 2 a 4 horas para predifundir los medicamentos antibacterianos, y luego colocarse en una incubadora a 37°C para cultivo, lo que puede retrasar el crecimiento de bacterias y obtener una zona de inhibición más grande.
[Editar este párrafo] Aplicación de las pruebas de sensibilidad a los medicamentos
Después de las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos, se deben seleccionar medicamentos altamente sensibles para el tratamiento, o se deben seleccionar dos medicamentos para ayudar a reducir la resistencia a los medicamentos. presiones. Al seleccionar medicamentos altamente sensibles, se debe considerar la vía de absorción del medicamento, porque nuestra prueba de sensibilidad a los medicamentos implica el contacto directo del líquido con las bacterias. Cuando se administran medicamentos a las aves, el cuerpo debe absorber el medicamento para lograr un efecto determinado. Por lo tanto, al medicar aves, los medicamentos altamente sensibles deben combinarse con métodos de administración adecuados para lograr buenos efectos terapéuticos.
Materiales de referencia:/view/611389.htm? es=ala0_1_1