¿Cuáles son los métodos de inmunoensayo?
(1) Radioinmunoensayo (RIA). La tecnología RIA utiliza antígenos o anticuerpos marcados con isótopos radiactivos (como 125I, 32P, 3H, etc.) y utiliza un detector de rayos gamma o un contador de centelleo líquido para medir la intensidad radiactiva de los rayos gamma o beta para determinar los anticuerpos. o antígenos. Incluye radioinmunoensayo caracterizado por antígenos marcados y ensayo inmunorradiométrico (IRMA) caracterizado por anticuerpos marcados. El primero utiliza principalmente el método de unión competitiva en fase líquida, que detecta tanto antígenos de moléculas grandes como antígenos de moléculas pequeñas; el segundo utiliza principalmente el método de fase sólida para detectar antígenos de moléculas grandes.
RIA representó una gran proporción de los primeros métodos de inmunoensayo de pesticidas establecidos, y estableció dieldrín, aldrín, 2,4-D y 2,4,5-T, y paratión y radioinmunoensayo para pesticidas como. paraquat. Aunque este método es muy sensible (el RIA suele ser de 10 a 9 g, 10 a 12 g o incluso 10 a 15 g) y tiene una amplia gama de aplicaciones, se requieren contadores costosos para realizar el RIA y también existen problemas como la radiación radiactiva y contaminación, por lo que los residuos de pesticidas están La aplicación y el desarrollo en el campo de la detección han estado sujetos a ciertas restricciones y están siendo reemplazados gradualmente por otros métodos de inmunoensayo.
(2) Inmunoensayo enzimático (EIA). EIA es una tecnología de inmunoensayo desarrollada después de RIA. El principio de detección es similar al del radioinmunoensayo, pero el marcador utilizado es una enzima que combina orgánicamente la reacción inmune específica de antígenos y anticuerpos con la catálisis eficiente de las enzimas y determina la actividad de la enzima unida a la fase sólida. cantidad de sustancia a medir. Las enzimas utilizadas como marcadores incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AKP), glucosa oxidasa (GO), ureasa, etc. Los soportes sólidos para reacciones de marcado de enzimas incluyen tubos de plástico de poliestireno, membranas, etc. Actualmente, las microplacas de 96 pocillos (MTP) se utilizan principalmente como soportes sólidos. Este tipo de placa tiene una gran capacidad de detección y una gran cantidad de muestras. Solo requiere un simple lector de microplacas para obtener datos de detección precisos. Algunos académicos también utilizan perlas magnéticas como materiales de fase sólida para realizar investigaciones de EIA. El principio es envolver materiales poliméricos (poliestireno, cloruro de polivinilo, etc.) fuera de pequeñas partículas metálicas (Fe2O3, Fe3O4) y luego unir químicamente los grupos amino. (-NH2), carboxilo (-COOH), hidroxilo (-OH) y otros grupos activos se acoplan luego con anticuerpos o antígenos para producir microperlas inmunes. La ventaja de este método es que las microperlas tienen una gran superficie específica y una fuerte capacidad de adsorción. Pueden suspenderse en la fase líquida y capturar rápida y uniformemente el analito en la muestra. Se separa rápidamente del líquido de muestra, lo que reduce el tiempo de detección y mejora la sensibilidad de detección.
Debido a que los reactivos marcados con enzimas son fáciles de preparar, estables y baratos, y la sensibilidad del inmunoensayo enzimático es cercana a la del radioinmunoensayo, la tecnología de EIA se ha desarrollado rápidamente en los últimos años y se han desarrollado una variedad de métodos de EIA. han sido desarrollados. Entre ellos, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es actualmente la tecnología de inmunoensayo enzimático más utilizada en la detección de residuos de pesticidas.
(3) Inmunoensayo de fluorescencia (FIA). El principio básico de la detección FIA es combinar orgánicamente la alta especificidad de los antígenos y anticuerpos con la mensurabilidad sensible de la fluorescencia y utilizar sustancias fluorescentes como trazadores para marcar anticuerpos, antígenos o moléculas de hapteno para preparar reactivos fluorescentes específicos de alta calidad. Cuando la sustancia fluorescente en el conjugado antígeno-anticuerpo se irradia con luz ultravioleta o luz azul, puede absorber energía luminosa y entrar en un estado excitado. Cuando regresa al estado fundamental desde el estado excitado, puede emitir la energía luminosa absorbida en forma de radiación electromagnética y producir fluorescencia. Dibujar una curva de concentración de pesticidas-intensidad de fluorescencia puede detectar cualitativa y cuantitativamente residuos de pesticidas en las muestras.
La fluoresceína adecuada para marcar anticuerpos, antígenos o moléculas de hapteno debe cumplir los requisitos: ① Debe tener grupos químicos que puedan formar enlaces ***valentes estables con moléculas de proteínas, o que se puedan convertir fácilmente en reacciones de este tipo sin destruyendo su estructura fluorescente ② Después del etiquetado, las estructuras químicas y las propiedades de la fluoresceína y los anticuerpos o antígenos no cambian ③ La eficiencia de la fluorescencia es alta y la cantidad necesaria para unirse a las proteínas es muy pequeña; el proceso es simple y rápido, y la fluoresceína libre y sus productos de degradación son fáciles de eliminar ⑤ El conjugado tiene un rendimiento estable en condiciones normales de almacenamiento y puede almacenarse y usarse durante mucho tiempo;
(4) Inmunoensayo quimioluminiscente (LCIA). LCIA se puede dividir en inmunoensayo quimioluminiscente (CLCIA) e inmunoensayo bioluminiscente (inmunoensayo bioluminiscente, BLCIA).
En 1976, Shroeder estableció por primera vez la tecnología de inmunoensayo de quimioluminiscencia homogénea utilizando el sistema de biotina (B)-avidina (A), y luego Halman y Velan la ampliaron al sistema heterogéneo. Ahora ha penetrado en todos los campos. de la investigación biológica. El principio es utilizar luminiscencia para indicar la combinación de antígeno y anticuerpo. Cuando el marcador luminiscente se combina con el anticuerpo o antígeno correspondiente, el sustrato actúa con la enzima, o produce una reacción redox con el agente luminiscente, o provoca sustancias fluorescentes (. como rubrene, etc.) ) excita y libera energía luminosa. Finalmente, se utilizó un fotómetro para medir la intensidad de luminiscencia y realizar análisis cuantitativos. Los marcadores luminiscentes comúnmente utilizados incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP), luminol, isoluminol, lofina, lucigen, oxalato de bis (2, 4, 6) -triclorobenceno), difenilglucinol y 6[N-(4-diaminobutil)-N-etil]-amino. -2,3-dihidrofenazina-1,4-diona (ABEI), etc. Cuando el anticuerpo (o antígeno) marcado con el marcador luminiscente mencionado anteriormente se une al antígeno (o anticuerpo) correspondiente en una determinada solución tampón de pH, emite luz bajo la acción de factores sinérgicos (como H2O2, etc.), y su intensidad de luminiscencia es consistente con la sustancia medida y es proporcional a la concentración, por lo que puede usarse para análisis cuantitativos.
El inmunoensayo luminiscente tiene las ventajas de una gran especificidad, alta sensibilidad (límite de detección de hasta 10-15 mol/L), rapidez (1-3 h) y fácil disponibilidad de materiales luminiscentes. Sin embargo, su proceso de luminiscencia y su intensidad a menudo se ven afectados por la estructura química de la propia sustancia luminiscente, el pH del medio, las sustancias luminiscentes sinérgicas y las impurezas de iones metálicos.
(5) Ensayo de inmunocromatografía con oro (goldimmuno-cromatography assay, GICA). El principio de la detección GICA es recubrir y solidificar el ligando (anticuerpo o antígeno) en forma lineal sobre una película microporosa como una membrana de nitrocelulosa. La etiqueta de oro coloidal se recubre adicionalmente con un ligando u otras sustancias y se fija en estado seco. un material absorbente. La acción capilar hace que la solución de la muestra nade en la tira de cromatografía. Cuando nada hacia el marcador de oro coloidal, si la muestra contiene el receptor que se va a analizar, se producirá una reacción inmune altamente específica en el primer paso, formando una. complejo inmunológico Cuando la sustancia continúa nadando hacia el área de recubrimiento lineal, se produce un segundo paso de reacción inmune altamente específica. El complejo inmunológico formado queda atrapado en el área lineal recubierta y se muestra una banda roja a través del oro coloidal etiquetado (detección). banda), mientras que la etiqueta libre cruza la banda de detección y se separa automáticamente de la etiqueta unida. Se puede lograr una determinación cualitativa o cuantitativa detectando la presencia o ausencia de color o la profundidad del color en la cinta2.
2 Detección de tiras reactivas con etiqueta dorada
El método GICA tiene las ventajas de resultados rápidos (5-20 minutos), económicos y claros, sin necesidad de habilidades operativas complejas ni equipos especiales. y fácil portabilidad. Sin embargo, en comparación con otros métodos de inmunoensayo, la sensibilidad de detección de este método es ligeramente menor y es principalmente adecuado para determinaciones cualitativas o semicuantitativas rápidas in situ. En la actualidad, este método se ha utilizado en muchos campos de investigación como la medicina y la biología, especialmente en los países desarrollados.
(6) Tecnología combinada de inmunoensayo y tecnología de análisis instrumental. La cantidad de información obtenida mediante el uso de una única tecnología de IA para el análisis de residuos de pesticidas es pequeña y la selectividad de los métodos de análisis físicos y químicos es relativamente pobre. Kramer et al. combinaron inmunoensayo y cromatografía líquida (LC) para simplificar el método de análisis y mejorar la eficiencia de la detección. La combinación de LC-IA combina la alta capacidad de separación de LC con la alta sensibilidad y especificidad de IA.
Este método analítico es particularmente adecuado para el análisis de residuos de múltiples componentes y el análisis de trazas. El acoplamiento de inmunoensayos con cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) puede reducir la reactividad cruzada en el análisis de pesticidas o metabolitos estructuralmente similares para reducir los falsos positivos.