Varios métodos de diagnóstico y comparación de la triquinelosis.
La triquinelosis es una enfermedad grave que afecta a humanos y animales. Fue descubierta por primera vez en humanos por el británico Peacock en 1828 y bautizada como Trichinella espiralis por Owen (1835). Mi país descubrió el primer caso de triquinosis humana en el Tíbet en 1965. La investigación sobre la triquinosis se centra en los métodos de diagnóstico.
El diagnóstico de la triquinelosis se divide principalmente en métodos de diagnóstico etiológico y métodos de diagnóstico inmunológico. El diagnóstico patogénico utiliza principalmente biopsia, que tiene una alta tasa de errores, causa trauma y es ineficaz. El diagnóstico inmunológico tiene alta sensibilidad y ha sido ampliamente utilizado en la investigación seroepidemiológica de la triquinelosis humana. Este artículo presenta principalmente métodos de diagnóstico inmunológico, como la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (1FAT), la prueba de tinción inmunoenzimática (1EST) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
1 Método de diagnóstico
1.1 Prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFAT)
1.1.1 Preparación de cortes de antígeno del tejido muscular infectado Tome el diafragma de cerdos infectados con triquinelosis Como material, se fijó en formalina neutra al 10%, se embebió en parafina convencional y se cortó en rodajas con un espesor de 5 a 10 micrones como adhesivo para las rodajas. Organice de 2 a 4 secciones en cada diapositiva. Después del secado, se realizó una desparafinación de rutina y las secciones se lavaron tres veces con PBS 0,01 molar, pH 7,4 y luego se cortaron en rodajas con una solución de peróxido de hidrógeno-metanol y suero de conejo normal diluido 1:20 veces a 37°C durante 20 minutos. Lave cada una con PBS como se indicó anteriormente y filtre con Las tiras de papel se pueden usar para absorber la humedad o secarlas naturalmente para convertirse en láminas de antígeno de diagnóstico y almacenarlas en un refrigerador a 4°C para su uso posterior.
1.1.2 Preparación de anticuerpos fluorescentes
1.1.2.1 Preparación de IgG anti-cerdo de conejo se sala con sulfato de amonio saturado, se desaliniza con Sephadex~G25 y se purifica. con celulosa DEAE. Después de inmunizar conejos con IgG de cerdo purificada para preparar suero anti-cerdo de conejo, la IgG anti-cerdo de conejo se purifica entonces según el método de purificación de IgG de cerdo.
1.1.2.2 Marcado de anticuerpos: Extraer con precisión 3 mg de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y añadir 0,3 ml de solución de carbonato de sodio de 0,5 mol/L para disolver completamente el FITC. Tome 6 ml de IgG anti-porcina de conejo de 10 mg/ml, agregue la solución de FITC gota a gota a temperatura ambiente y revuelva mientras agrega. Una vez completada la adición, continúe agitando a temperatura ambiente durante 3 horas.
1.1.2.3 Purificación e identificación de la calidad de los anticuerpos fluorescentes: Dializar la solución de anticuerpos fluorescentes marcada con 0,01 mol de PBS pH 7,4 a 4°C durante 4 a 5 días hasta que no se escapen más pigmentos fluorescentes. Los anticuerpos fluorescentes dializados se sometieron luego a cromatografía en Sephadex-G25. Después de medir los valores de densidad a 495 nm y 280 nm con un espectrofotómetro UV, se calculó que el valor F/P del anticuerpo fluorescente marcado era 2.
1.1.3 Método de prueba y determinación del resultado: Añadir gota a gota PBS que contenga 20% de suero normal de conejo y 1% de albúmina sérica bovina a la pieza de antígeno e incubar a 37°C durante 20 minutos con enjuague; Se diluyó PBS y luego se añadió gota a gota PBS que contenía un 5 % de suero de conejo normal en PBS 1:100 para obtener el suero de prueba y se incubó a 37 °C durante 45 minutos después de lavar con PBS, se diluyó una solución de anticuerpo fluorescente diluida 1:10 veces; Se añadió gota a gota y se incubó a 37°C durante 45 minutos. Después de lavar con PBS, se añadió tampón de glicerol no fluorescente y se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia. Las secciones con fluorescencia de color amarillo verdoso en la superficie cortada de las larvas musculares se consideraron positivas.
Cada lote de pruebas debe incluir controles de suero de referencia positivos y negativos y controles de sección de tejido muscular normal porcino.
1.2 Prueba de tinción con inmunoenzimas (IEST)
1.2.1 Suero a analizar 35 sueros de cobayos infectados con Trichinella espiralis de 8 semanas de edad en laboratorio.
1.2.2 Preparación de Antígeno: Se sacrifican ratas que han sido infectadas artificialmente con larvas de Trichinella espiralis durante 2 meses, se toman los músculos del diafragma y los músculos internos de las patas traseras y se extrae una media de 7 larvas por campo visual. se comprimen bajo el microscopio. Después de lavar con tampón fosfato, use un microtomo de congelación para cortar en secciones congeladas de 6 micras de espesor de las larvas. Monte 5 trozos de tejido en cada portaobjetos y fíjelos con acetona. a -20°C para su uso posterior.
1.2.3 Pasos de la operación: en las secciones congeladas de larvas de Trichinella espiralis, diluya el suero de prueba a 5, 10, 20 con 0,01 mol/L de PBS, pH 7,4~7,6 (que contiene 0,05% de Tween~20). , se dejaron caer concentraciones de proporciones 40, 80 y 160 (la concentración inicial es la solución madre de suero) sobre las rebanadas y se estableció un control de suero negativo para cada prueba.
Colóquelo en una caja humidificada, incúbelo a 35°C durante 60 minutos, lave 3 veces con 0,01 mol/l de PBS, pH 7,4~7,6, 5 minutos cada vez, seque con secador, agregue gota a gota la proteína de estafilococo A marcada con enzima (HRP~SPA). e incubar como se indicó anteriormente Lavar, agregar solución de sustrato (tetrahidrocloruro de 3'3-diaminobencidina-peróxido de hidrógeno) gota a gota, reaccionar a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos, desechar el sustrato, enjuagar rápidamente con agua destilada y colocar la pieza húmeda bajo un microscopio óptico ordinario. Observe los resultados de la reacción.
1.2.4 Juicio de resultados: Registre los resultados según la profundidad del color de la sección larvaria en secciones musculares de ratas infectadas. La reacción no tiene color (-) y aparece de color marrón claro (+), marrón (++) o tostado (+++). Si el título sérico LEST a analizar es ≥1:10 (+), se considera LEST positivo.
1.3 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas se puede dividir en 10 tipos según métodos de ensayo heterogéneos, pero hay 4 tipos comúnmente utilizados: tipo directo , tipo indirecto, tipo sándwich de doble anticuerpo, tipo competitivo de anticuerpo en fase sólida. Este artículo presenta principalmente el tipo indirecto (método del kit ELISA convencional).
1.3.1 Preparación del kit Seleccionar un kit ELISA apropiado según la situación.
1.3.2 Preparación de las muestras de prueba: Recoja 2 gotas de sangre de la vena de la oreja del cerdo bajo prueba, colóquelas en un trozo de papel de filtro de 1 cm × 2 cm y sumérjalo en 0,01 mol/ L pH7,4 PBS (que contiene 0,05 % de Tween-20) 2 ml, 37 ℃ durante 2 horas o 4 ℃ durante la noche, reservar. El suero negativo y positivo se diluyó 1:200 y el suero analizado se diluyó 1:100.
1.3.3 Método de operación y valoración de resultados
1.3.3.1 Agregue 100 microlitros de muestra de prueba a cada pocillo de la caja de diagnóstico y déjelo reposar durante 2 minutos a temperatura ambiente (25 °C).
1.3.3.2 Reacción: Sacuda la solución de prueba, agregue 1 gota (40 μl) de la solución de prueba No. 1 a cada pocillo y déjela reposar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
1.3.3.3 Lave y sacuda la solución de prueba No. 1, agregue 1 gota (40 μl) de la solución de prueba No. 2 a cada pocillo y enjuague inmediatamente con agua destilada o agua del grifo durante más de 5 minutos. veces.
1.3.3.4 Seque el líquido residual en la placa de reacción para desarrollar el color. Agregue 1 gota de la solución de prueba No. 3 a cada pocillo, luego agregue 1 gota de la solución de prueba No. 4, mezcle suavemente. y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 2 ~ 3 minutos.
1.3.3.5 Juicio: Sobre fondo blanco, el azul es positivo y la absorbancia es ≥0,3; el incoloro es negativo y la absorbancia es ≤0,1.
2 Comparación
La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFAT), la prueba de tinción inmunoenzimática (IEST) y la prueba inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISA) son actualmente métodos inmunológicos comúnmente utilizados para el diagnóstico de método de triquinosis.
La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFAT) se utilizó para diagnosticar la triquinelosis antes. La ventaja es que los anticuerpos marcados con fluorescencia preparados se pueden utilizar para la detección de una variedad de antígenos y sistemas de anticuerpos. En la etapa inicial, se usó el gusano completo como antígeno y, después de la detección mediante el método del tubo de ensayo, se desarrolló para usar el cuerpo del gusano o rodajas de músculo del gusano como antígeno. Cui Jing et al. utilizaron antígeno de sección congelada de larvas de Trichinella para detectar 216 sueros de pacientes con Trichinella con IFAT. La tasa de anticuerpos positivos fue del 90,74% en la primera semana después del inicio de la enfermedad y aumentó a 91,30. % en la segunda semana hubo diferencia significativa (P<0,025), alcanzando 95,83% y 100% respectivamente en la 3ra y 4ta semana. Las tabletas de antígeno de larvas de Trichinella espiralis se pueden almacenar a -20°C durante al menos 2,5 años sin perder su actividad.
Los principios de la prueba de tinción inmunoenzimática (IEST) y ELISA son básicamente similares. Chen Yatang et al. utilizaron secciones congeladas de músculo de ratas infectadas artificialmente con Trichinella espiralis como antígenos y utilizaron 1EST para detectar el suero a analizar. Entre 11 pacientes con infección por Trichinella espiralis confirmada por biopsia muscular, la tasa positiva fue del 81,8%. diferente al del grupo de control normal y otros parásitos. Hay una diferencia significativa en la infección. El experimentador cree que su especificidad y sensibilidad no son menores que las de ELISA. Zhang Yuguang et al. utilizaron el diafragma y los músculos mediales de las patas de ratas infectadas artificialmente durante más de 3 meses para crear secciones congeladas como antígenos, y compararon las pruebas IEST y intradérmicas para evaluar a 1412 estudiantes de secundaria. La tasa positiva de IEST fue del 11,4%. , y la tasa positiva de la prueba cutánea fue del 16,93%.
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se reconoce actualmente como un mejor método para detectar anticuerpos específicos de Trichinella espiralis, con una sensibilidad y especificidad extremadamente altas. El método ELISA para detectar Trichinella espiralis se ha utilizado en el extranjero como inspección de rutina antes del sacrificio de los cerdos.
Después de una práctica a largo plazo en nuestro país, la tecnología experimental se ha mejorado continuamente y se ha desarrollado desde ELISA convencional hasta SPA-ELISA, DOT-ELISA, etc. El kit de diagnóstico ELISA de Trichinella espiralis también se ha desarrollado y promocionado con éxito para su uso en pruebas. Hoy en día, ELISA se ha utilizado ampliamente en la investigación epidemiológica y el diagnóstico clínico de la triquinelosis. Sin embargo, ELISA también tiene desventajas: su funcionamiento es relativamente engorroso y requiere altas condiciones experimentales, y todavía es difícil aplicarlo a nivel de base.