Principios de la tecnología de hibridomas
El principio se explica en los siguientes tres pasos principales.
(A) Selección y fusión de células
El propósito de establecer la tecnología de hibridoma es preparar anticuerpos monoclonales contra antígenos, por lo que un lado de las células de fusión debe seleccionar células B inmunes al antígeno. Generalmente células del bazo de animales inmunizados. El bazo es un lugar importante para la acumulación de células B. Independientemente del estímulo inmunológico, el bazo tendrá una respuesta de anticuerpos significativa. El otro lado de las células fusionadas es mantener la proliferación celular después de la fusión celular, una propiedad que sólo tienen las células tumorales. Seleccionar células del mismo sistema puede aumentar la tasa de éxito de la fusión. El mieloma múltiple es un tumor maligno del linaje de células B, por lo que es un compañero de fusión ideal de los esplenocitos.
El uso de agentes de fusión celular provoca un cierto grado de daño en las membranas celulares, haciendo que las células se adhieran fácilmente entre sí y se fusionen entre sí. El mejor efecto de fusión debería ser el menor grado de daño celular y la mayor frecuencia de fusión. El polietilenglicol (PEG1 000 ~ 2 000 ~ 2 000) es actualmente el agente de fusión celular más utilizado y su concentración de aplicación general es del 40% (p/v).
(2) Aplicación de medios selectivos
La fusión celular es un proceso físico aleatorio. En suspensiones de células mixtas de esplenocitos de ratón y células de mieloma de ratón, las células fusionadas aparecen en diversas formas. Por ejemplo, esplenocitos y células tumorales fusionados, esplenocitos y esplenocitos fusionados, células tumorales y células tumorales fusionadas, esplenocitos no fusionados, células tumorales no fusionadas y formas poliméricas de células. Las células del bazo normales sólo sobreviven en el medio de cultivo durante 5 a 7 días y no requieren un examen especial. Los agregados de células también son susceptibles a la muerte; sin embargo, las células tumorales no fusionadas requieren una detección y eliminación especiales.
Generalmente existen dos formas de sintetizar el ADN celular. La vía principal es sintetizar nucleótidos a partir de azúcares y aminoácidos y luego sintetizar ADN. El ácido fólico es una coenzima importante en este proceso de síntesis. Otra vía auxiliar es la síntesis de ADN en presencia de hipoxantina y timidina, catalizada por la hipoxantina fosforribosiltransferasa (HGPRT) y la timidina quinasa (TK). Hay tres componentes clave en el medio selectivo para la fusión celular: hipoxantina (H), metotrexato (A) y timidina (T), por lo que los prefijos de estos tres componentes se denominan medio HAT. El metotrexato es un antagonista del ácido fólico que impide que las células tumorales sinteticen ADN a través de vías normales. Sin embargo, las células tumorales utilizadas para la fusión eran líneas celulares HGPRT seleccionadas del medio tóxico, por lo que no pudieron crecer en este medio. Sólo las células fusionadas tienen las características genéticas de ambos padres y pueden sobrevivir y reproducirse en medio HAT durante mucho tiempo.
(3) Limitación de la dilución y selección de la especificidad del antígeno
En la inmunización animal, se deben seleccionar antígenos de alta pureza. Un antígeno suele tener múltiples determinantes. La esencia de la respuesta inmune humoral producida por un animal después de haber sido estimulado por un antígeno es la secreción de anticuerpos por muchas poblaciones de células B, con sólo unas pocas células B dirigidas contra el epítopo objetivo. Debido a que la fusión celular es un proceso estocástico, es necesario descartar una proporción considerable de fusiones celulares no relacionadas entre las células fusionadas. El proceso de detección generalmente se divide en dos pasos: en primer lugar, la detección de anticuerpos de las células de fusión y, en segundo lugar, la detección de anticuerpos específicos basados en estas. Diluir completamente las células fusionadas para que el número de células distribuidas en cada pocillo de la placa de cultivo esté entre 0 y varias células (el 30% de los pocillos son 0 para garantizar que cada pocillo sea una sola célula) y tomar el sobrenadante después del cultivo. Líquido, utilice ELISA para detectar células con alta secreción de anticuerpos; este proceso a menudo se denomina clonación. Estas células positivas se clonan nuevamente y se encuentran líneas celulares positivas para anticuerpos contra el antígeno objetivo mediante ELISA recubiertas con antígenos específicos. Después de la proliferación, se congelan, se cultivan in vitro o se inoculan en la cavidad abdominal de los animales.