Método de preparación de la biopelícula de Listeria monocytogenes
1. Inocular la cepa congelada a -80°C en medio de cultivo sólido BHI e incubar a 37°C durante 65,438±08 horas para su activación. Se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron durante la noche en 5 ml de medio BHI líquido a 37°C y 200 rpm. Al día siguiente, transfiera a 1 litro de medio BHI líquido fresco en una proporción de 1:100 y continúe cultivando hasta que la DO600 sea 1,0.
2.2.2 Ultrafiltración y concentración para extraer vesículas de membrana. Cuando las bacterias se cultivan hasta que la DO600 sea 1,0, centrifugar a 4°C 6000 r/min durante 20 minutos para recoger el sobrenadante, filtrar con un filtro de 0,45. Membrana filtrante de μm o 0,22 μm y luego transferir a un tubo de concentración de ultrafiltración con un peso molecular de 100 kD y centrifugar a 4°C y 4000 r/min durante 20 minutos. Tomar el líquido concentrado y centrifugarlo durante 3 horas a 4°C, 365, 438 + 065, 438 + 074 r/min. Desechar el sobrenadante y suspender el precipitado con 65, 438 + 00 ml de tampón fosfato. Resuspender el precipitado. Suspender en 65.438+0 ml de tampón fosfato, filtrar con una membrana de filtro de 0,22 μm, comprobar la esterilidad y almacenar a -80 °C. Las vesículas de membrana extraídas de EGDe, EGDE δ PRFA y EGDE δ PRFA+Perl3-PRFA* se representan como EGDe-MV, δδprfA-MV y prfA*-MV, respectivamente.
3. Extraiga las vesículas de membrana mediante centrifugación en gradiente de densidad Optiprep. Prepare la solución de centrifugación en gradiente Optiprep utilizando DMEM con concentraciones del 25%, 30%, 35%, 40% y 45% respectivamente. Aspire 1 ml de producto extraído mediante el método de concentración por ultrafiltración (igual que 1.2.2), transfiéralo a un tubo de centrífuga Beckman, luego agregue 2 ml de 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % opti prep en secuencia, 4 °C, 31174r/. Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente entre el 30 % y el 35 % de los componentes en el tubo de centrífuga Beckman, agregue 10 ml de tampón fosfato y vuelva a ultracentrifugar. Después de centrifugaciones repetidas tres veces, se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en 1 ml de tampón fosfato, se filtró a través de una membrana de 0,22 μm, se probó su esterilidad y se almacenó a -80 °C, que es la vesícula de membrana extraída.
4. Utilice el método BCA para determinar la concentración de proteínas de las vesículas de membrana y calcular la producción de vesículas de membrana. Para conocer métodos de medición específicos de la concentración de proteína MV, consulte las instrucciones del kit de determinación de concentración de proteína BCA. Utilice el método de extensión en placa de dilución para contar el número de colonias cuando la OD600 es 1,0 y utilice la cantidad de proteína obtenida por 1013 UFC para determinar el rendimiento de vesículas de membrana.
5. Observar la morfología de las burbujas de membrana bajo microscopía electrónica de tinción negativa. Remoje la malla de cobre en la muestra de MV durante unos 20 minutos y luego sáquela. Toque el papel de filtro verticalmente con la malla de cobre para eliminar el exceso de líquido. Luego, sumerja la malla de cobre en la solución de tinte PTA durante 5 minutos, sáquela y séquela naturalmente a la sombra durante 2-3 días, y luego podrá usarla para observación con microscopía electrónica.
6. Efecto sobre la formación de biopelículas bacterianas, para el cultivo y detección de biopelículas bacterianas, ver Feng Feifei et al. Después de diluir las MV de las tres cepas a la misma concentración (0,2 mg/mL), añadir 100 μL de las MV correspondientes a una placa de 96 pocillos que contiene 100 μL de solución bacteriana (misma cepa o diferentes cepas) en una proporción de 1 :1. Además, también se configuraron dos conjuntos de referencias sin MV: un grupo añadió una cantidad igual de solución bacteriana y el otro grupo añadió una cantidad igual de tampón fosfato. Después de las operaciones anteriores, las placas de 96 pocillos se cultivaron a 37°C durante 24, 48 y 72 horas respectivamente. Pasado el tiempo de cultivo correspondiente, utilice un lector de microplacas para medir el valor de OD600 y detectar su crecimiento. Posteriormente, se descartó el medio de cultivo de cada pocillo, el biofilm generado se lavó con agua destilada, se secó a temperatura ambiente, se tiñó con violeta cristal de oxalato de amonio al 1% y se midió su valor de absorción de luz DO595. Los datos experimentales se analizaron utilizando Origin8 y SPSS22. Las biopelículas teñidas con cristal violeta se observaron directamente bajo un microscopio invertido, se fotografiaron y se registraron.
7. Detección de la actividad hemolítica de vesículas de membrana La determinación de la actividad hemolítica se basó en el método de Xinhui et al. Después de diluir MV de diferentes cepas a la misma concentración (0,2 mg/ml), agregue una cierta cantidad de MV a un tubo de centrífuga que contenga 1 ml de suspensión de glóbulos rojos. Agregue la misma cantidad de tampón fosfato al grupo de control negativo y al grupo de control negativo. grupo de control positivo. Agregue la misma cantidad de agua esterilizada. Además, agregue una cantidad igual de MV a 1 ml de suspensión de glóbulos rojos, seguido de 2 mmol/LDTT.
Incubar el tubo de centrífuga a 37 °C durante 3 horas, luego centrifugar a temperatura ambiente a 2600 r/5 min durante 5 minutos, absorber 800 μl del sobrenadante y medir el valor OD543 en la cubeta desechable, que es el valor de actividad hemolítica de las MV.
8. El efecto de las vesículas de membrana sobre el peso corporal, la tasa de supervivencia, la tasa de pupación y el tiempo de desarrollo de las larvas del gusano del algodón [13]. Después de diluir MV de diferentes cepas a la misma concentración (0,2 mg/mL), se absorbieron 5 μm-MV y se inyectaron debajo del primer pie ventral de las larvas. Al grupo de control se le inyectó la misma cantidad de tampón fosfato, con 18 larvas. en cada grupo. Después de la inyección, las larvas se pesaron cada 24 horas y se calcularon la tasa de supervivencia, la tasa de pupación y el tiempo de desarrollo larvario (desde la fecha de compra hasta el último estadio). El método de cálculo de los datos es: tasa de pupación = número de pupas/número total de insectos de prueba × 100% tasa de supervivencia = número de supervivientes/número total de insectos de prueba × 100%;