El proceso de preparación de anticuerpos monoclonales
(3) Solución nutritiva FCS-1640 al 2,5% 2. Método de operación (1) Tirar del cuello o matar al ratón con CO2. (2) Remojar y desinfectar el ratón con alcohol al 70%, retirarlo y fijarlo en un plato plano, y retirar el bazo en condiciones asépticas. (3) Coloque el bazo en 5 ml de solución 1640 que contenga FCS al 2,5 % y lave suavemente los glóbulos rojos del bazo con un baño de hielo. (4) Utilice unas pinzas para apretar suavemente el bazo y preparar una suspensión de células del bazo y utilice un tubo capilar para transferir la suspensión a un tubo de ensayo pequeño. (5) Coloque el tubo de ensayo pequeño en posición vertical durante 3 minutos para permitir que el tejido conectivo grande se hunda y transfiera la suspensión celular al tubo de centrífuga. (6) Llene el tubo de centrífuga con FCS-1640 al 2,5% y centrifugue a 400 g durante 7 min ~ 10 min (prepare las células de la médula ósea al mismo tiempo). (7) Resuspender el sedimento con aproximadamente 10 ml de medio de cultivo nuevo. (8) Repita los pasos [6] y [7]. (9) Cuente las células y utilice tinción con azul tripán y microscopía de contraste de fases para comprobar que el número de células viables debe ser superior al 80%. (2) Células de mieloma Las células de mieloma pueden producir y secretar grandes cantidades de inmunoglobulinas. Después de la fusión de dichas células tumorales, el título de anticuerpos secretores puede verse afectado o reducido, por lo que es necesario seleccionar células de mieloma no secretoras con deficiencia de inmunoglobulinas. Las condiciones para seleccionar células de mieloma son: ① La fuente de la línea celular tumoral debe ser la misma cepa que la del ratón con células del bazo, de modo que su antígeno de histocompatibilidad sea consistente ② Las células de mieloma deben estar en un estado inactivo y no producir gamma; globulina o secretada fuera de las células; ③ El crecimiento de las células de mieloma requiere una mayor densidad celular, preferiblemente 106 células/ml ④ La tasa de crecimiento es rápida y el tiempo de reproducción es corto; Las líneas celulares de mieloma comúnmente utilizadas producidas por ratones Balb/c incluyen: ①s 194/5 xxo bu 1; ② SP2/0-Ag14 (denominada SP2-X?); —AG8.6.5.3 (denominado 653); ④FO 653 es el más utilizado. Es un plasmocitoma inducido por aceite mineral 4-metil-15 alcano y cultivado para formar una cepa resistente a 8-azaguanina (MOPC). . Generalmente, las células de mieloma se introducen directamente desde las unidades relevantes y se almacenan en un tanque de nitrógeno líquido a -195 °C. Se reviven, proliferan y se pasan durante el experimento. Debido a que las células del mieloma son semiadherentes y se desprenden fácilmente, no es necesario el tratamiento con enzimas pancreáticas. Para prevenir el atavismo, se pueden añadir 15 µg/ml de 8-azaguanina al medio de cultivo antes de la fusión. Tome aproximadamente 1 × 107 ~ 6 × 107 fase de crecimiento logarítmico (es decir, cultivo durante 15 h ~ 20 h), centrifugue a temperatura ambiente (400 g) durante 10 minutos y precipite con FCS-1640 al 2,5 %. (3) Células alimentadoras En el cultivo celular in vitro, es difícil que una sola o una pequeña cantidad de células sobrevivan y se reproduzcan. Se deben agregar otras células vivas para permitirles crecer y reproducirse. Las células agregadas se llaman células alimentadoras. En el proceso de fusión celular y selección monoclonal, una población crece y se multiplica en función de un pequeño número de células individuales, por lo que se deben utilizar células alimentadoras en este proceso. Se puede utilizar una variedad de células animales como células alimentadoras, tales como células normales del bazo, timocitos, células de derrame peritoneal, etc. , a menudo se seleccionan células del exudado peritoneal, principalmente macrófagos y linfocitos. La ventaja de utilizar células de derrame peritoneal es que, por un lado, son células alimentadoras y, por otro, los macrófagos pueden fagocitar células muertas y restos celulares, creando un buen entorno para el crecimiento de células fusionadas. La fuente de células peritoneales pueden ser ratones singénicos con células de mieloma. También pueden ser otros tipos de ratones, como los ratones C57 y los ratones Kunming. Materiales (1) Varios ratones (ratones Balb/c o C57). (2) Solución de sacarosa al 11,6 % (autoclave a 10 libras de presión durante 30 minutos). 2. Método de operación (1) Mata a los ratones tirando de sus cuellos. (2) Remojar en alcohol al 70 % durante 65438 ± 00 minutos para su desinfección. (3) Corte el abdomen del ratón con tijeras quirúrgicas, retire la piel y exponga la cavidad abdominal. (4) Use una jeringa para inyectar 4 ml de solución de sacarosa al 11,6% en la cavidad abdominal, frótela suavemente con los dedos durante 1 minuto, luego use una jeringa para retirar el líquido peritoneal y agregarlo al tubo de centrífuga. (5) Centrifugar a 65438±0000 rpm durante 65438±00 minutos. (6) Tome el sobrenadante y utilice medio selectivo HAT para convertir las células en una suspensión. Se utilizó tinción con azul tripán para contar las células viables de modo que cada mililitro contenía 400.000 células viables.
(7) Utilice una pipeta de 1 ml para inocular células en una placa de micropocillos, 0,05 ml por pocillo, que contenga 20.000 células, y colóquela en una incubadora de CO2 para cultivo, que se puede utilizar para la fusión y clonación celular. Si descubre que la cantidad de células alimentadoras en el cultivo mucho después de la fusión es baja, puede agregar más al reemplazar las células.