Establecimiento de un modelo heterocigoto de células madre embrionarias de ratón con gen de osteoprotegerina deficiente

[Resumen] Objetivo: Establecer un modelo de células madre embrionarias de ratón heterocigoto para la desactivación del gen de la osteoprotegerina (OPG) y sentar las bases para establecer un modelo animal con desactivación genética para el desarrollo de fármacos contra la osteoporosis. Métodos Se amplificaron dos brazos homólogos mediante PCR y los dos fragmentos de recombinación homólogos se insertaron en el vector XpPNT para construir un vector dirigido a la desactivación del gen OPG. Después de la linealización y purificación, las células madre embrionarias de ratón se transdujeron mediante electroporación, se examinaron y se cultivaron con G418 y ganciclovir para obtener clones doblemente resistentes y se extrajo el ADN genómico. Identificación de clones de células madre embrionarias de recombinación homóloga mediante PCR e hibridación Southern. Resultados: Se obtuvieron 124 clones con doble resistencia mediante detección dual de fármacos y se identificó un clon homólogo de células madre embrionarias recombinantes mediante PCR e hibridación Southern. Conclusión En conclusión, este estudio obtuvo con éxito clones de células madre embrionarias de ratón heterocigotos OPG(-/), lo que sentó las bases para obtener ratones knockout para el gen OPG mediante microinyección y reproducción por apareamiento, y para estudiar la función del gen OPG in vivo. También se han establecido modelos animales knockout para el desarrollo de fármacos contra la osteoporosis.

[Palabras clave] gen knockout; células madre embrionarias; agentes protectores óseos; osteoporosis

¿Establecimiento de un modelo heterocigoto de knockout del gen OPG? Células ES externas

¿Qiao Jian? Ah, ¿qué pasa? NV, ¿la novena persona como Ning Guang y otros? The First Affiliated Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200232

[Resumen] Objetivo obtener células madre embrionarias de recombinación homóloga con desactivación del gen OPG. Métodos: Después de obtener dos brazos de homología mediante PCR, se construyó un vector dirigido al exón 2 de OPG y a una pequeña parte del intrón 2 utilizando el fragmento Xbal/BamHI de 3,3 kb como brazo corto y el fragmento NotI/SalI de 3,9 kb como brazo largo. . El ADN del vector dirigido linealizado y purificado se transfectó en células ES mediante electroporación, y luego algunas de estas líneas de células ES sobrevivieron a la selección de G418 y Ganciclovir. ¿dos? ¿veneno? Los clones resistentes se amplificaron e identificaron mediante PCR y transferencia Southern. ¿El resultado es 124 en total? ¿veneno? Se cosecharon clones resistentes y uno de ellos se confirmó como positivo. Conclusión Los resultados de este experimento sientan las bases para seguir estableciendo un modelo de ratón con desactivación genética de OPG y un estudio en profundidad in vivo de OPG.

[Palabras clave] knockout; células ES; osteoprotegerina; osteoporosis

La osteoporosis es una enfermedad caracterizada por la pérdida ósea y la destrucción de la microestructura ósea que conducen a una mayor fragilidad ósea y susceptibilidad a fracturas. que también son enfermedades comunes que afectan la salud humana. Cómo establecer modelos animales específicos es un tema candente en campos relacionados. La osteoprotegerina (OPG) es una glicoproteína secretada descubierta en los últimos años [1]. Tiene la actividad de inhibir la diferenciación y resorción de osteoclastos y pertenece a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR). Las investigaciones muestran que la OPG desempeña un papel importante en la patogénesis, la prevención y el tratamiento de la osteoporosis, la artritis reumatoide, la enfermedad de Paget y las enfermedades malignas del tejido óseo (osteosarcoma, tumor de células gigantes, cáncer metastásico). Este estudio utilizó métodos de clonación molecular para diseñar y construir un vector de direccionamiento para la mayor parte del exón 2 y parte del intrón 2 del gen OPG de ratón, y eliminó el gen OPG en células ES de ratón mediante tecnología de direccionamiento genético La preparación de ratón knockout para el gen OPG. El modelo mediante microinyección ha sentado las bases.

1 Materiales y métodos

1.1 Los materiales experimentales del plásmido vector pblue scriptⅰ(/-) y el plásmido XpPNT fueron proporcionados por el Shanghai Southern Model Organism Center, el vector de clonación de productos de PCR pGEM? Teasy es un producto de Promega. ¿Varias enzimas de restricción, ADN ligasa T4, kits de etiquetado de ADN con cebador aleatorio, varias enzimas Taq, reactivos relacionados con la PCR y RT? Los kits de PCR se adquirieron de las empresas Takara y NEB. Los marcadores de ADN (escalera de 100 pb, escalera de 1 kb, fragmento Lamda-HindIII) se adquirieron de NEB y Takara. La proteinasa K se adquirió de Shanghai Gongsheng Bioengineering Technology Service Company. Trizol se adquirió de GibcoBRL e Invitrogen.

El pequeño kit de extracción de plásmidos se adquirió de Huashun Bioengineering Company y Shanghai Gong Sheng. Kit de extracción de plásmidos. El kit de extracción rápida en gel se adquirió de Qiagen. La solución de hibridación Hyb se adquirió de Clontech Company. Los reactivos químicos convencionales se compran principalmente a Sigma y a China Pharmaceutical Group Shanghai Chemical Reagent Company. Los isótopos radiactivos [α-32P]-dCTP y [α-32P]-dATP son productos de Amersham Company. Reactivos relacionados con el cultivo celular: incluido el medio líquido DMEM (alto nivel de glucosa, L? glutamina, sin piranato de sodio, ¿células ES? calificadas), aminoácidos no esenciales, glutamina, PBS sin Ca2/Mg2, PBS que contiene Ca2/Mg2, β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), suero fetal de ternera (¿ES? ¿Células? Calificadas), G418, ganciclovir (GANC), dimetilsulfóxido (DMSO), penicilina/cadena Are micina, tripsina (tripsina/EDTA), colágeno (gelatina) y otros reactivos Gibco? BRL es un producto de Sigma y LIF (ESGROTM) es un producto de CHEMICON (Australia). Las placas de cultivo celular de 35 mm, 100 mm, las placas de cultivo celular de 24, 48 y 96 pocillos, los tubos de centrífuga y otros consumibles son todos productos de Corning. Síntesis y secuenciación de cebadores: completadas por Shanghai Shenyou Biotechnology Company. Las secuencias de cebadores se diseñaron utilizando el paquete de software DNAstar basándose en los datos de secuencia. Línea celular ES: introducida en ratones de 13.ª generación in vitro, la línea celular CJ7 (derivada de ratones Sv129) es conservada por la Oficina de Investigación y Enseñanza de Genética Médica de la Facultad de Medicina Básica de la Segunda Universidad Médica de Shanghai.

1.2 Método experimental

Construir 1.2.1 vector objetivo

1.2.1.1 Extraer ADN genómico para recolectar células ES en buenas condiciones, agregar la cantidad adecuada de solución de lisis y proteinasa K, 56°C durante la noche; al día siguiente, las muestras se centrifugaron a temperatura ambiente a 12.000 rpm durante 10 min; Recoger el sobrenadante, precipitar con etanol absoluto, enfriar previamente con hielo y lavar con etanol al 70% después de secar al aire, disolver una cantidad adecuada de agua pura y almacenar a 4°C para su uso posterior;

Los dos brazos de homología se obtuvieron mediante el método de PCR 1.2.1.2 y la secuencia del gen OPG de ratón se obtuvo de Genebank mediante BLAST. De acuerdo con la secuencia proporcionada por NCBI GenBank, utilice Primerselect del software DNAstar para determinar los brazos de homología aguas arriba y aguas abajo de los dos pares de cebadores. Cebador aguas arriba del brazo de homología aguas arriba: CGTAGGATCCGTACCTCAGCCCTGAAGAT (correspondiente al gen OPG 14842-14861 pb); cebador aguas abajo: tcggtctagacaggaggctag AAGAGCACA (correspondiente al gen OPG 18152-18171 pb); 60 ℃, 50 s; 72 ℃, 3,5 minutos 35 ciclos: 72 ℃, 65438 ± 00 minutos, siempre. La longitud del brazo de homología aguas arriba es de 3331 pb. Cebador aguas abajo del brazo de homología: ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGTAACT (correspondiente al gen OPG 18580 ~ 18598 pb) y cebador aguas abajo: GTGGGCGGCCGCAAGCCAGGACTGTCAACA (correspondiente al gen OPG 22478 ~ 22497 BP); 1.5 ℃, 50 s; 72 ℃, 4 minutos. 35 ciclos: 72°C, 65438±00 minutos; 4°C, siempre. La longitud del brazo de homología aguas abajo es de 3918 pb.

1.2.1.3 Clonar correctamente el fragmento de ADN en el vector XpPNT. ¿Recuperar los productos de PCR de los dos brazos de homología y conectarlos al vector de clonación de productos de PCR pGEM? Detección, secuenciación e identificación tras transformación y amplificación de E. coli. Los brazos de homología aguas abajo se introdujeron en el vector x usando NotI/SalI mediante métodos convencionales. PpnT, luego inserte el brazo de homología aguas arriba en X? La identificación de las enzimas de restricción y la determinación de la secuencia del vector PpnT mostraron que la secuencia era correcta.

El vector de direccionamiento se denominó 5-3opg-XpPNT, se linealizó mediante digestión con endonucleasa de restricción NotI, se recuperó y se almacenó a -20°C para su uso posterior.

1.2.2 Gen dirigido a células ES

1.2.2.1 Transferencia genética por electroporación de células ES Tome 0,8 ml de suspensión de células individuales ES con una densidad de aproximadamente 1,2 × 107/ml. Añadir 0,1 ml de PBS que contiene Ca2 y Mg2 (que contiene aproximadamente 30 μg de NotI linealizado 5-3 opg? XpPNT), mezclar y transferir a una copa de electroporación estéril. Después de un electrochoque de pulso único con parámetros eléctricos de 240 V y 500 μF a temperatura ambiente, las células se resuspendieron en medio ES y la suspensión celular se sembró uniformemente en dos placas colagenizadas de 35 mm. Después de 24 horas de recuperación en medio no selectivo, se examinaron los fármacos.

1.2.2.2 Selección de fármacos La selección de fármacos para células resistentes comienza 24 horas después de la transferencia genética por electroporación. Entre ellas, 1 placa de 30 mm se cultivó en medio selectivo que contenía los fármacos selectivos G418 (concentración final 400 g/ml) y ganciclovir (concentración final 2 mmol/L), y la otra placa todavía estaba en medio no selectivo. un control. Después de 7 a 8 días de detección, los clones de células ES crecerán hasta convertirse en colonias de células visibles y podrán recolectarse. Se seleccionaron 124 clones de células resistentes a los medicamentos en 14 días* * *.