Al preparar el kit Elisa utilizando el método sándwich de doble anticuerpo. ¿Cómo determinar la concentración de anticuerpo para el recubrimiento?
1 Principio de ELISA
La base del ELISA es la fijación del antígeno o anticuerpo y la enzima de. la marca de antígeno o anticuerpo. El antígeno o anticuerpo unido a la superficie del vehículo sólido aún conserva su actividad inmunológica, y el antígeno o anticuerpo marcado con enzima conserva su actividad inmunológica y su actividad enzimática. La muestra (anticuerpo o antígeno) que se analiza reacciona con el antígeno o anticuerpo en la superficie del soporte sólido. El complejo antígeno-anticuerpo formado sobre el soporte sólido se separa de otras sustancias en el líquido mediante lavado. Luego se agrega el antígeno o anticuerpo marcado con enzima y se une al portador sólido mediante la reacción. En este momento, la cantidad de enzima en la fase sólida es proporcional a la cantidad de sustancia a detectar en la muestra. Después de agregar el sustrato para la reacción enzimática, la enzima cataliza el sustrato en un producto coloreado. La cantidad de producto está directamente relacionada con la cantidad de sustancia que se mide en la muestra, por lo que se puede analizar cualitativa o cuantitativamente en función de la profundidad del color. Debido a la alta eficacia catalítica de la enzima, los resultados de la reacción inmune se amplifican indirectamente, lo que hace que el ensayo sea muy sensible.
2. Tipos de ELISA
ELISA se puede utilizar para detectar antígenos y anticuerpos. En este método, se necesitan tres tipos de reactivos: 1) antibióticos o anticuerpos en fase sólida, conocidos como "inmunosorbentes"; (2) antígenos o anticuerpos marcados con enzimas llamados conjugados (3) el sustrato para la reacción enzimática. Se pueden diseñar varios tipos de métodos de detección según la fuente de los reactivos, el estado de la muestra y las condiciones específicas de la detección. Se utilizan principalmente los siguientes tipos de ELISA para pruebas clínicas:
2.1 Método sándwich de doble anticuerpo para la detección de antígenos
El método sándwich de doble anticuerpo es el método más utilizado para detectar antígenos Los pasos de operación son los siguientes:
1) Combinar anticuerpos específicos con portadores sólidos para formar anticuerpos sólidos. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos y las impurezas.
2) Añadir la muestra a analizar y mantener caliente para que reaccione. El antígeno de la muestra se combina con el anticuerpo en fase sólida para formar un complejo antígeno-anticuerpo en fase sólida. Lave para eliminar otros materiales no adheridos.
3) Añadir anticuerpo marcado con enzima e incubar la reacción. El antígeno del complejo inmune en fase sólida se une al anticuerpo marcado con enzima. Lave bien los anticuerpos marcados con enzimas no unidos. En este momento, la cantidad de enzima transportada por el vehículo en fase sólida está relacionada con la cantidad de antígeno detectado en la muestra.
4) Añadir sustrato para el desarrollo del color. Las enzimas en la fase sólida catalizan el sustrato en productos coloreados. La cantidad de antígeno en una muestra se puede medir mediante comparación de colores. En pruebas clínicas, este método es adecuado para detectar diversos antígenos macromoleculares, como HBsAg, HBeAg, AFP, hCG, etc. Siempre que se obtenga el anticuerpo contra el antígeno a detectar, se puede utilizar para recubrir el vehículo en fase sólida y preparar el conjugado enzimático. Si la fuente de los anticuerpos es el antisuero, entonces los anticuerpos utilizados para el recubrimiento y el marcado enzimático deben obtenerse de diferentes especies de animales. Por ejemplo, si se usan anticuerpos monoclonales, generalmente se seleccionan dos anticuerpos monoclonales dirigidos a diferentes determinantes del antígeno para recubrir el vehículo en fase sólida y preparar el conjugado enzimático, respectivamente. Este método sándwich de dos sitios tiene una alta especificidad. La muestra que se va a analizar y el anticuerpo marcado con enzima pueden reaccionar juntos a temperatura ambiente para una detección en un solo paso.
En el método de un solo paso, cuando el contenido del antígeno a detectar en la muestra es muy alto, el exceso de antígeno se combina con el anticuerpo en fase sólida y el anticuerpo marcado con enzima respectivamente, y ya no forma un "complejo sándwich", similar a una precipitación. El fenómeno del exceso de antígeno en la reacción. En este momento, el valor de absorbancia del color desarrollado después de la reacción (ubicado en la banda de exceso de antígeno) es el mismo que el valor de absorbancia de una determinada concentración de antígeno en la curva estándar (ubicada en la banda de exceso de anticuerpo) (ver 1.3. 2). Si se mide utilizando métodos normales, el resultado será inferior al contenido real. Este fenómeno se denomina efecto gancho porque la curva estándar se curva hacia abajo después de alcanzar su valor máximo. Cuando el efecto gancho es severo, la reacción puede incluso producir resultados falsos negativos sin desarrollo de color. Por lo tanto, cuando se utiliza un reactivo de un solo paso para determinar niveles anormalmente altos de sustancias en la muestra (como HBsAg, AFP, hCG en orina, etc.). ), preste atención al valor más alto en el rango detectable. Preparación de anticuerpos monoclonales de alta afinidad.
Si hay muchos determinantes idénticos en diferentes sitios de la molécula que se está analizando, como el determinante A del HBsAg, se puede utilizar el mismo anticuerpo monoclonal para recubrir la fase sólida y preparar el conjugado enzimático respectivamente. Sin embargo, se debe prestar atención al subtipo de HBsAg durante la detección. Hay cuatro subtipos de HBsAg: ADR, ADW, AYR y AYW. Aunque la reactividad del determinante A de cada subtipo es la misma, esta también es una cuestión a la que se debe prestar atención cuando se utilizan anticuerpos monoclonales para métodos sándwich.
Otro punto a tener en cuenta al utilizar el método sándwich de doble anticuerpo para detectar antígenos es la interferencia del factor reumatoide (FR). RF es un autoanticuerpo, principalmente del tipo IgM, que puede unirse al fragmento Fc de muchas IgG animales. Si la muestra de suero utilizada para la detección de sándwich de doble anticuerpo contiene RF, se puede utilizar como componente antigénico y puede combinarse con anticuerpos en fase sólida y anticuerpos marcados con enzimas al mismo tiempo, provocando reacciones falsas positivas. El fragmento f(ab’) o Fab se utiliza como reactivo para conjugados enzimáticos ya que se elimina. Eliminando así las interferencias de radiofrecuencia. Se ha incluido como índice de evaluación para este tipo de reactivos si los reactivos ELISA sándwich de doble anticuerpo se ven afectados por la RF (ver 6.2).
El método sándwich de doble anticuerpo es adecuado para la determinación de antígenos bivalentes o macromoleculares superiores, pero debido a que no puede formar un sándwich de dos puntos, no es adecuado para la determinación de haptenos y antígenos monovalentes de molécula pequeña. .
2.2 Método sándwich de doble antígeno para detectar anticuerpos
El método de reacción es similar al método sándwich de doble anticuerpo. Recubra el antígeno específico, prepare el conjugado enzimático y detecte el anticuerpo correspondiente. La diferencia con el método indirecto es que se utiliza un antígeno marcado con enzima en lugar de un anticuerpo marcado con enzima. En este método, la muestra a analizar se puede utilizar directamente para la determinación sin dilución, por lo que su sensibilidad es relativamente mayor que la del método indirecto. Este método se utiliza habitualmente para detectar anti-HB entre los marcadores de hepatitis B. La clave de este método es la preparación de un antígeno marcado con enzimas, y se debe encontrar un método de etiquetado adecuado en función de las diferentes estructuras del antígeno.
2.3 Método indirecto de detección de anticuerpos
El método indirecto es un método de detección de anticuerpos comúnmente utilizado. El principio es utilizar antianticuerpos marcados con enzimas (anticuerpos antiinmunoglobulina humana) para detectar anticuerpos unidos a antígenos en fase sólida, por lo que se denomina método indirecto (consulte la Figura 2-3). Los pasos de la operación son los siguientes:
1) Combinar el antígeno específico con el portador sólido para formar un antígeno sólido. Lavar para eliminar el antígeno no unido y las impurezas. 2) Añadir suero diluido e incubar la reacción. Los anticuerpos específicos en el suero se combinan con antígenos sólidos para formar complejos antígeno-anticuerpo sólidos. Después del lavado, sólo los anticuerpos específicos permanecen en el soporte sólido y otros componentes del suero se eliminan durante el proceso de lavado.
3) Añadir anticuerpos marcados con enzimas. La Ig antihumana marcada con enzimas se puede utilizar para detectar anticuerpos totales, pero generalmente se utiliza la IgG antihumana marcada con enzimas para detectar anticuerpos IgG. Los anticuerpos del complejo inmune en fase sólida se unen a los anticuerpos marcados con enzimas, marcando así indirectamente la enzima. Después del lavado, la cantidad de enzima sobre el soporte sólido se correlaciona positivamente con la cantidad de anticuerpo detectado en la muestra.
4) El revelado de color del sustrato se utiliza principalmente para la detección de anticuerpos patógenos y el diagnóstico de enfermedades infecciosas. La ventaja del método indirecto es que siempre que se cambie el antígeno de recubrimiento, se puede utilizar el mismo anticuerpo marcado con enzima para establecer un método para detectar el anticuerpo correspondiente. La clave del éxito del método indirecto reside en la pureza del antígeno. Aunque a veces el recubrimiento con antígeno crudo puede lograr resultados prácticos y efectivos, aun así se debe purificar tanto como sea posible. Para mejorar la especificidad de la prueba, se debe prestar especial atención a la eliminación de impurezas que pueden reaccionar con el suero humano normal, como los antígenos recombinantes que utilizan E. coli como enzimas diseñadas. Si contiene componentes de E. coli, es probable que reaccione con anticuerpos anti-E. coli en la sangre de pacientes infectados con E. coli. El antígeno no debe contener sustancias que reaccionen con Ig anti-humana marcada con enzimas, como. antígenos del plasma humano o del tejido humano. Si la Ig no se elimina, también aparecerá en la prueba.
Otro factor de interferencia en el método indirecto es la alta concentración inespecífica en suero normal. La IgG específica en el suero del paciente representa sólo una pequeña porción de la IgG total. La IgG tiene una fuerte adsorción y la IgG no específica puede adsorberse directamente en el portador de fase sólida y, a veces, también puede adsorberse en la superficie del antígeno recubierto. Por lo tanto, en el método indirecto, el antígeno suele recubrirse con una proteína no relacionada (como la albúmina sérica bovina). Para bloquear las vacantes en la fase sólida, además, la muestra debe diluirse (1:40~1:200) por adelantado durante el proceso de detección para evitar que un fondo negativo excesivo afecte el juicio de los resultados.
2.4 Método competitivo para la detección de anticuerpos
Este método se puede utilizar para detectar anticuerpos específicos cuando es difícil eliminar sustancias que interfieren en el material antigénico o cuando es difícil obtener suficientes sustancias purificadas. antígeno. El principio es que los anticuerpos de la muestra compiten con una cierta cantidad de anticuerpos marcados con enzimas para unirse al antígeno en fase sólida. Cuantos más anticuerpos haya en la muestra, menos anticuerpos marcados con enzimas se unirán a la fase sólida, por lo que la reacción positiva es más ligera que la reacción negativa. Si el antígeno es de alta pureza, la fase sólida se puede recubrir directamente. Si hay sustancias que interfieren en el antígeno, será difícil lograr un recubrimiento directo. Se puede utilizar el método de recubrimiento de captura, es decir, primero se recubre el anticuerpo correspondiente al antígeno en fase sólida y luego se agrega el antígeno para formar el antígeno en fase sólida. Las impurezas del antígeno se lavan para eliminarlas y luego se añaden la muestra y el anticuerpo marcado con enzima para realizar una reacción de unión competitiva. La detección competitiva de anticuerpos está disponible en una variedad de formatos para la unión competitiva de muestras y anticuerpos marcados con enzimas a antígenos en fase sólida. El ELISA anti-HBc generalmente utiliza este método. Otro modo es agregar anticuerpos en fase sólida a la muestra y al antígeno para una unión competitiva y luego agregar anticuerpos marcados con enzimas después del lavado.
2.5 Método competitivo para detectar antígenos
Dado que el método sándwich carece de dos o más sitios, los antígenos de molécula pequeña o haptenos no pueden determinarse mediante el método sándwich de doble anticuerpo, se puede utilizar la competencia. Forma. El principio es que el antígeno de la muestra compite con una cierta cantidad de antígeno marcado con enzima para unirse al anticuerpo en fase sólida. Cuanto más antígeno haya en la muestra, menos antígeno marcado con enzima se unirá a la fase sólida y más claro será el color final. Este método se utiliza comúnmente para la determinación ELISA de hormonas de molécula pequeña, fármacos, etc.
2.6 Método de recubrimiento de captura para la detección de anticuerpos
La detección de anticuerpos IgM se utiliza para el diagnóstico precoz de enfermedades infecciosas. El ELISA indirecto generalmente sólo es adecuado para la detección de anticuerpos totales o anticuerpos IgG. Si se utiliza el método indirecto de recubrimiento de antígeno para detectar directamente anticuerpos IgM, algunos anticuerpos IgM no pueden unirse a la fase sólida debido a la alta concentración de anticuerpos IgG en la muestra. Por lo tanto, si se utiliza anti-IgM humana como anticuerpo secundario, los anticuerpos IgM se determinan indirectamente. Las muestras deben tratarse con proteína A o anticuerpos anti-IgG para eliminar la interferencia de IgG. En los ensayos clínicos, el método de recubrimiento de captura se utiliza a menudo para medir la IgM de anticuerpos. Primero, la fase sólida se recubre con anticuerpos anti-IgM humana para capturar la IgM en la muestra de suero (incluidos los anticuerpos IgM específicos contra el antígeno y la IgM no específica). Luego se añade el antígeno. Este antígeno se une sólo a IgM específica y luego se usa una enzima para marcar anticuerpos específicos contra ese antígeno. Luego reacciona con el sustrato y el color se correlaciona positivamente con la IgM de la muestra. Este método se utiliza a menudo para el diagnóstico precoz de infecciones virales. El modo de detección de los anticuerpos contra el virus de la hepatitis A (VHA) se muestra en la Figura 2-7. El factor reumatoide (FR) también puede interferir con la detección de anticuerpos IgM mediante el método de recubrimiento de captura, provocando reacciones falsas positivas. Por lo tanto, recientemente han ganado popularidad los métodos indirectos para neutralizar la IgG y la detección se realiza con este reactivo.
2.7 Método ABS-ELISA
ABS significa sistema avidina-biotina. La avidina es una glicoproteína con un peso molecular de 60.000. Cada molécula está compuesta por cuatro subunidades que pueden unirse a la biotina. La biotina es un compuesto de molécula pequeña con un peso molecular de 244. Los ésteres derivados de hidroxisuccinimida preparados por métodos químicos pueden formar productos marcados con biotina con varios tipos de moléculas, como proteínas y azúcares. El método de etiquetado es bastante sencillo. La unión entre biotina y avidina es muy específica y la afinidad es mucho mayor que la reacción antígeno-anticuerpo. Una vez combinados, son extremadamente estables. Dado que una avidina puede unirse a cuatro moléculas de biotina, los métodos ABS y ELISA se pueden dividir en dos tipos: avidina-biotina marcada con enzima (método LA) y avidina-biotina con puente (método ABC). Ambos utilizan anticuerpos (o antígenos) marcados con biotina para reemplazar los anticuerpos (antígenos) marcados con enzimas en el sistema ELISA original. En el laboratorio, la biotina sólida primero se hace reaccionar con avidina sin marcar y luego se agrega biotina marcada con enzimas para mejorar aún más la sensibilidad. La avidina se extrae de la clara de huevo en su etapa inicial. Este tipo de oavividina es una glicoproteína básica que tiene una fuerte adsorción al portador de poliestireno y puede aumentar el fondo cuando se usa en ELISA. La estreptavidina extraída de Streptomyces no tiene este inconveniente y tiende a reemplazar a la primera en aplicaciones ELISA.
Dado que ABS-ELISA utiliza dos reactivos más que ELISA ordinario y aumenta los pasos operativos, ABS-ELISA no se usa ampliamente en pruebas clínicas.