Secuenciación del transcriptoma de un solo núcleo

Secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq): una tecnología que estudia la detección de la expresión de genes nucleares a nivel de una sola célula extrayendo núcleos de células individuales de una muestra, luego aislando y etiquetando los núcleos. Proporciona una plataforma de investigación y aplicación a nivel unicelular para tejidos complejos como tejido cerebral, corazón, riñón, etc. o algunas muestras congeladas raras, que pueden explorar más tipos de células patógenas potenciales y facilitar la exploración de la heterogeneidad y patogénesis de células tumorales.

El proceso de preparación de suspensiones unicelulares suele ser un factor importante en la variabilidad experimental. ¿Cómo obtener suficiente suspensión unicelular? Esta es la primera dificultad en los experimentos, especialmente aquellos con células raras o que son difíciles de disociar; la membrana nuclear es más fuerte que la membrana celular, por lo que el núcleo puede permanecer intacto después de que se rompe la membrana celular del tejido congelado. Dado que solo implica fragmentación mecánica y purificación simple, los pasos operativos de snRNA-seq están relativamente simplificados, son convenientes para experimentos y la estabilidad mejora enormemente en comparación con scRNA-seq.

La secuenciación de núcleos unicelulares snRNA-seq se puede aplicar a muestras congeladas porque extrae núcleos celulares para la secuenciación, haciendo un gran uso de aquellas muestras congeladas con datos fisiológicos y patológicos claros. Para muestras frescas con baja tasa de éxito de disociación; o la recolección de muestras es difícil y el ciclo de recolección es largo, como la evaluación de una muestra en diferentes etapas, o si la muestra inicial se incluye en el grupo según los resultados del procesamiento; o muestras con células grandes y formas irregulares. Esto se puede resolver usando snRNA-seq.

Debido a que el tejido puede extraer núcleos celulares directamente del estado congelado, la actividad transcripcional de las células se ha inhibido y fijado en este estado, por lo que el estado transcripcional ya no cambiará y la autenticidad de los resultados También se mejorará.

La alteración directa de las células por medios mecánicos o químicos no introduce un sesgo de disociación. En teoría, se pueden recuperar todos los tipos de células y se puede obtener un mapa celular más completo y completo.

Aunque algunos estudios han comparado la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) con la secuenciación nuclear unicelular (snRNA-seq), las transcripciones se expresan en la misma medida en toda la célula y el núcleo. En teoría, si no hay moléculas de ARN en el citoplasma, snRNA-seq puede no ser tan bueno como scRNA-seq para identificar el estado transcripcional de la célula. Al mismo tiempo, debido a la baja proporción de ARNm maduro con colas poliA en el núcleo, para algunas muestras, puede haber un pequeño riesgo al usar snRNA-seq para detectar genes en cada núcleo, lo que no favorece la identificación de subtipos celulares.

Aunque snRNA-seq puede obtener un tipo de célula más completo y completo, la proporción de tipos de células parciales obtenidas no es tan buena como la de scRNA-seq, que muestra principalmente células inmunes.

Slyper, M., Porter, C.B.M., Ashenberg, O., et al., Caja de herramientas RNA-Seq unicelular y uninuclear para tumores humanos frescos y congelados. Nat Rev 26, 792–802 (2020). /p/394585391

Aquí hablamos principalmente de la diferencia entre ARNm nuclear y ARNm celular: hay una gran cantidad de pre-ARNm dentro y fuera de la célula, y esta parte contiene información de intrones. La experiencia con datos generales es que la alineación de intrones de PBMC es de alrededor de 20 y el transcriptoma nuclear es de alrededor de 45.

/HC/en-us/articles/360000087552-¿Por qué-tengo-un-alto-porcentaje-de-lecturas-asignadas-a-regiones-intrones?

Para Para comprender este proceso, necesitamos comprender los mecanismos básicos de formación y transporte nuclear del ARNm deseado. Al mismo tiempo, necesitamos saber cuándo se agregó el PolyA que capturamos al extremo 3'. Se recomienda leer Gene X aquí.

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Entonces echemos un vistazo a cómo se hace en el artículo:

/HC/en-us/articles/360004350911-¿Cómo puede ser el porcentaje de lectura de la región del exón alineada? mayor que la alineación Porcentaje de lecturas del transcriptoma -

Dadas las diferencias en el ARNm nuclear, hay algunas advertencias a tener en cuenta durante el análisis posterior.

Habib, n., Avraham-Davidi, I., Basu, a., et al. Métodos Nat 14, 955–958 (2017). Número 8, 19 (2020). /jgamache 014/sn RNA-seq-flujo de trabajo