Gel Bio
1. Determinación - peso molecular, PI
Cuando el peso molecular, PI y otras propiedades físicas de la proteína objetivo no están claros, se puede determinar mediante electroforesis PAGE o cromatografía. Las columnas empaquetadas Superose HR con amplio rango de separación son ideales para determinar el peso molecular de proteínas desconocidas. El PI se puede medir fácilmente con una pequeña cantidad de medio de intercambio iónico en varios tubos de ensayo que contienen diferentes tampones de pH y se puede seleccionar el pH óptimo del tampón de purificación.
2. Elija un método de cromatografía
Si no sabe mucho sobre las propiedades o la composición de la muestra de su proteína objetivo, puede probar varios métodos de purificación diferentes:
Primero utilice el método de filtración en gel más común y elija medios con un amplio rango de separación, como Superose y Sephacryl HR, para separar la muestra en diferentes componentes según el peso molecular.
2. Unir la proteína diana a medios de cromatografía de afinidad que contengan ligandos o anticuerpos específicos. También pueden usarse diversos medios de acoplamiento activados para acoplar sustratos y receptores para proteínas diana y luego usarse para unirse a la proteína diana. Se pueden obtener muestras de alta pureza en un solo paso.
Las muestras de triple volumen normalmente se concentran y purifican mediante cromatografía de intercambio iónico. Las muestras eluidas con alto contenido de sal se pueden purificar mediante cromatografía hidrófoba. La cromatografía hidrófoba utiliza el principio de adsorción con alto contenido de sal y elución con bajo contenido de sal. La muestra eluida se puede someter directamente a cromatografía de adsorción, como el intercambio iónico. Estos dos métodos suelen utilizarse indistintamente durante el proceso de purificación.
3. Purificación: una gran cantidad de producto crudo
Para evitar el bloqueo de la columna, al procesar una gran cantidad de solución cruda, se utilizan medios de intercambio iónico de partículas grandes, como las perlas grandes de sefarosa. , SepharoseXL y Sepharose de flujo rápido generalmente se usan en espera. La tecnología de adsorción en lecho extendido utiliza una variedad de medios optimizados para capturar proteínas directamente de caldos de fermentación que contienen células alteradas o extractos de tejido. Centrifugación, ultrafiltración y purificación preliminar en uno. Mejore la tasa de recuperación y acorte el ciclo de purificación.
4. Purificación: muestra de sulfato de amonio
El método de precipitación con sulfato de amonio se utiliza a menudo para la purificación preliminar de las muestras. Las muestras procesadas se encuentran en un estado rico en sal y son muy adecuadas para la purificación directa. cromatografía hidrofóbica. Para el intercambio iónico es necesario desalar primero con Sephadex G-25. La cromatografía hidrofóbica es una tecnología relativamente nueva y, con el creciente número de tipos de medios, se integra gradualmente en varios procesos de producción. El kit de ensayo Hitrap HIC y el kit de ensayo RESOURCE HIC se pueden utilizar para seleccionar los medios más adecuados y las condiciones de purificación óptimas entre ocho medios hidrófobos. Las muestras eluidas con bajo contenido de sal se pueden diluir ligeramente o someter directamente a otra cromatografía de adsorción.
5. Purificación - moléculas de azúcar
Lectinas inmovilizadas, como concanavalina, maní, cebada, etc. , puede unir residuos de carbohidratos y es ideal para separar componentes glucosilados de membranas celulares, células e incluso orgánulos subcelulares, y purificar glicoproteínas. Dos medios de cromatografía de afinidad Sepharose 6MB con lectinas están diseñados para capturar células enteras o complejos grandes, como vesículas de membrana.
6. Purificación-Proteínas de membrana
A menudo se utilizan detergentes para separar las proteínas de la membrana y mantener su actividad. El detergente iónico debe seleccionarse con una carga opuesta a la proteína objetivo para evitar competir con la proteína objetivo por el medio de intercambio durante el proceso de intercambio iónico, eliminando así el detergente. Los detergentes no iónicos se pueden eliminar mediante cromatografía hidrófoba.
7. Purificación: anticuerpos monoclonales, antígenos
La mayoría de los anticuerpos monoclonales son IgG y las fuentes principales son la ascitis y los sobrenadantes de cultivos de tumores fusionados. Retire la IgG antes del cultivo. La proteína recombinante A Sepharose Mabselect y la rProtein A Sepharose FF tienen mayor capacidad y especificidad para IgG y menos eliminación de población. La proteína A caída se puede eliminar fácilmente mediante intercambio iónico Q Sepharose HP o filtración en gel Superdex 200.
La cromatografía hidrofóbica Phenyl Sepharose HP también es adecuada para purificar IgG. Los anticuerpos del huésped y la IgG contaminante se pueden eliminar mediante purificación y pulido mediante filtración en gel Superdex 200.
El método más eficaz para purificar el antígeno IgG es acoplar IgG con medios de acoplamiento activados como CNBr y Sefarosa FF activada por NHs, y luego obtener más antígeno IgG.
HiTrap IgM es un anticuerpo monoclonal que se utiliza para purificar células tumorales fusionadas. La cantidad de unión es de 5 mg de IgM. HiTrap IgY se utiliza especialmente para purificar IgY, con una capacidad de unión de 100 mg de IgY pura.
8. Purificación-Proteínas Recombinantes
La idea de purificación ya debería incorporarse al diseño y construcción de proteínas recombinantes. La mayoría de las muestras se mezclan con células rotas o productos lisados, por lo que la tecnología de adsorción en lecho expandido STREAMLINE es muy adecuada para la separación gruesa. Amersham Biosciences ofrece tres sistemas de fusión para una expresión rápida y una purificación en un solo paso.
Las proteínas expresadas junto con la glutatión S-transferasa se expresaron utilizando un vector de fusión GST, se purificaron mediante cromatografía de afinidad con glutatión Sefarosa 4B y luego se escindieron con trombina o factor Xa.
2. El vector de fusión de Proteína A fusiona la proteína a expresar con el sitio de unión de IgG de la proteína A, y la purifica con IgG Sepharose 6 FF.
Dos proteínas de fusión marcadas con histidina se pueden quelar con metal Ni2+ usando agarosa quelante FF, y las proteínas de fusión se pueden quelar con histidina en condiciones normales o desnaturalizantes (urea 8M). El kit HisTrap proporciona un conjunto completo de métodos de purificación de proteínas His-Tag.
9. Purificación: proteína de inclusión
La proteína de inclusión a menudo debe disolverse en clorhidrato de guanidina 6 M o urea 8 M. Cuanto mayor sea la pureza de la muestra de proteína de cuerpos de inclusión, mejor será el efecto de renaturalización. El medio de cromatografía de fase inversa SOURCE 30 RPC es muy adecuado para purificar productos crudos antes de la renaturalización y se puede regenerar con 1MnaOH. La tasa de recuperación de la renaturalización de las proteínas del cuerpo de inclusión purificadas mediante este método mejora significativamente.
10. Renaturalización en fase sólida de proteínas de inclusión
Mucha literatura informa que las proteínas de inclusión se inmovilizan (adsorben) en medios cromatográficos en condiciones desnaturalizantes, generalmente utilizando diversos medios de cromatografía de intercambio iónico Sepharose FF. . Además, no es necesario diluir la muestra en grandes cantidades y la renaturalización y la purificación preliminar se combinan en una sola, lo que ahorra mucho tiempo y mejora la tasa de recuperación.
El método de renaturalización en fase sólida también se utiliza para la renaturalización y purificación directa de proteínas de fusión de histidina expresadas en forma de cuerpos de inclusión mediante cromatografía de metales quelados HiTrap. Las proteínas de fusión que contenían múltiples lisinas se renaturalizaron y purificaron directamente mediante cromatografía de afinidad con heparina HiTrap. Ambas columnas preempaquetadas de cromatografía de afinidad son reutilizables y más convenientes y duraderas que los kits comunes.
11. Purificación de principios activos de las hierbas medicinales chinas
La composición química de las hierbas medicinales chinas es extremadamente compleja. Por ejemplo, si se utiliza metanol para separar glucósidos flavonoides, primero se eliminan por lavado los trisacáridos, seguidos de los disacáridos, monosacáridos y agliconas. Sephadex LH-20 puede utilizar una variedad de reactivos como agua, etanol, acetona, cloroformo, etc., y se usa ampliamente para la separación de una variedad de productos naturales, incluidos alcaloides, glucósidos, flavonoides, quinonas, lípidos, terpenos, esteroides, etc.
Los alcaloides quedan cargados positivamente en tampones ácidos y se convierten en sales. Las columnas de cromatografía de intercambio catiónico HiTrap SP pueden separar una variedad de alcaloides con estructuras muy similares. Por el contrario, los flavonoides, antraquinonas, saponinas y ácidos orgánicos son solubles en tampones alcalinos y tienen mejores efectos de separación en la columna de intercambio aniónico HiTrap Q.
Generalmente, para purificar polisacáridos se utilizan tamices moleculares como Sephadex y Sephacryl. Si el peso molecular es inferior a 600 KD y se requiere una resolución más alta, puede elegir el Superdex de nueva generación. Las plantas en general pueden contener polisacáridos solubles en agua, solubles en ácidos y álcalis. La cromatografía de fase inversa SOURCE5, 15, 30RPC también es muy adecuada para la detección, separación y preparación de amplificación de diversos ingredientes activos de la medicina tradicional china. Dado que los ingredientes de la medicina tradicional china son muy complejos, el rango utilizable de cromatografía de fase inversa es PH1-14, y se puede lavar y regenerar con NaOH 1 M y HCl 1 M. En comparación con la cromatografía de fase reversa en gel de sílice tradicional, es más fácil optimizar el proceso y limpiarlo en el lugar, y tiene una vida útil más larga.
12. Purificación-Péptidos
Las fuentes de péptidos incluyen péptidos extraídos naturalmente, péptidos sintéticos y péptidos recombinantes.
Los péptidos se degradan fácilmente mediante enzimas, pero pueden renaturalizarse a partir de disolventes o codisolventes orgánicos, por lo que se purifican mediante cromatografía de fase inversa altamente selectiva, como SOURCE 30RPC, SOURCE 15RPC, SOURCE 5RPC o miniperlas y monoperlas de intercambio iónico. Superdex Peptide HR es una columna preempaquetada de filtración en gel especialmente diseñada para la purificación de moléculas de péptidos. Puede usarse con cromatografía de fase reversa para crear mapas de péptidos más refinados. Las moléculas de péptidos se pueden preparar mediante intercambio iónico combinado con filtración en gel. Ciudad Médica Multifuncional
13. Purificación - Ácido Nucleico y Virus
La purificación de ácidos nucleicos se utiliza para eliminar contaminantes que afectan la secuenciación o la PCR. Los ácidos nucleicos se pueden dividir aproximadamente en ADN plasmídico, ADN de fagos y productos de PCR. Los virus también pueden verse como macromoléculas de ácidos nucleicos. Al igual que el ADN plasmídico, podemos utilizar medios de filtración en gel Sephacry S-1000 SF, Superose o Sepharoce 4FF para eliminar impurezas y luego cooperar con el intercambio iónico de plasma Mono Q y SOURCE Q para separar los ácidos nucleicos.
14. Purificación - Oligonucleótido
Es ampliamente utilizado en ADN antisentido, secuenciación de ARN, PCR y síntesis de ADNc. Después de la síntesis, los subproductos de los oligonucleótidos que contienen tritilo se pueden eliminar utilizando el intercambio aniónico Mono Q o una fuente rápida de baja contrapresión Q a pH 12 para evitar la aglutinación y la pérdida de grupos protectores. La capacidad de carga es mucho mayor que la cromatografía de fase inversa y puede usarse para preparaciones a gran escala. Las secuencias fallidas sin grupos tritilo se pueden eliminar mediante una columna ProRPC de fase reversa.
15. Desalado y eliminación de moléculas pequeñas
Utilizar medios filtrantes en gel Sephadex G10, G15, G25, G50, etc. Puede eliminar moléculas pequeñas con alta eficiencia y la capacidad de procesamiento puede alcanzar el 30% del volumen del lecho. Después de la inyección, solo necesita recolectar 1/3-1/2 del volumen de eluato de la primera columna y se puede utilizar la desalinización HiPrep (26 ml).
16. Purificación de la vacuna
Utilice el medio de filtración en gel Sepharose 4FF para purificar la vacuna y eliminar las proteínas impurezas del medio de cultivo. La capacidad de procesamiento puede ser superior al 10% del volumen del lecho. La altura de la columna es generalmente de 40 a 70 cm y todo el proceso dura aproximadamente media hora. Las vacunas producidas con este método incluyen las vacunas contra la hepatitis B, la rabia, la fiebre hemorrágica, la influenza, la tuberculosis y la polio. Sephacryl S-500HR se puede utilizar en vacunas de pequeño peso molecular, como la vacuna contra la hepatitis A.
17. Análisis de polímeros antibióticos
Desde la edición del año 2000, la Farmacopea China exige que el porcentaje de polímeros en la ceftriaxona sódica se determine mediante el método de filtración en gel Sephadex G10.
18. Vectores virales purificados para terapia génica
SORRCE 15Q
19. Plásmidos purificados para terapia génica
Q Sepharose. 1. Eliminación de endotoxinas
Las endotoxinas también se llaman pirógenos. Al contener grasa A, azúcar y proteínas, es un polímero compuesto cargado negativamente.
La porción grasa de la endotoxina es altamente hidrofóbica. Sin embargo, se aglomerará en condiciones de alto contenido de sal y no se puede utilizar para cromatografía hidrófoba. El kit de prueba de cromatografía hidrófoba (17-1349-01) se puede utilizar para seleccionar medios que se unan a proteínas diana y eliminen endotoxinas.
La endotoxina está estrechamente unida al medio de intercambio aniónico q o DEAE Sepharose Fast Flow. Después de la elución, la proteína objetivo se puede eliminar con tampón con alto contenido de sal o NaOH.
CNBr o NHS Sepharose FF se pueden utilizar para acoplar sustratos de endotoxina como LAL y PMB para formar automáticamente un medio de cromatografía de afinidad que se une a la endotoxina. Las endotoxinas suelen ser polímeros que se eliminan eficazmente mediante cromatografía de filtración en gel.
2. Elimina los ácidos nucleicos de las proteínas.
Una gran cantidad de ácido nucleico aumenta la viscosidad de la muestra, expande el área, aumenta la contrapresión y reduce la resolución y el caudal. Las pruebas de drogas y de alimentos también tienen límites estrictos en cuanto al contenido de ácido nucleico.
El problema del ácido nucleico que expresa proteínas en las células es particularmente grave. Los ácidos nucleicos están cargados negativamente.
Durante la purificación preliminar, se puede eliminar una gran cantidad de ácidos nucleicos utilizando medios de intercambio catiónico como Streamline, SP Sepharose Big Beads, SP o CM Sepharose FF, SP SepharoseXL, etc. para unirse a la proteína objetivo.
Los ácidos nucleicos se disociarán de las proteínas bajo un alto contenido de sal. Los medios de cromatografía hidrofóbica son muy adecuados para unir proteínas objetivo y eliminar ácidos nucleicos mientras se purifican las proteínas.
El ácido nucleico se corta en trozos pequeños mediante la nucleasa, que se pueden eliminar fácilmente mediante filtración en gel para una purificación fina.
3. Eliminación - Virus y Microorganismos
Los virus y microorganismos pueden convertirse en patógenos y deben reducirse tanto como sea posible. Combinar diferentes técnicas cromatográficas, utilizar agua para inyección y desinfectar y limpiar periódicamente instrumentos y geles con NaOH puede evitar el aumento de contaminantes.
La mayoría de los virus tienen una capa lipídica. Los virus pueden ser inactivados por S/D (disolvente/detector) con carga opuesta a la proteína objetivo, como Triton y Tween. Luego, la proteína objetivo se puede combinar con un medio de intercambio iónico apropiado (como CM Sepharose FF) para eliminar S/D.
Otros contaminantes pueden cambiar el pH y la fuerza iónica para que interactúen con la molécula objetivo. desprendimiento o inactivación. Los medios de filtración en gel Superdex y varios medios de adsorción SOURCE son buenos medios de purificación fina que pueden eliminar una variedad de trazas de contaminantes. Los geles se refieren a mezclas de partículas con tamaños que oscilan entre 1 angstrom y 10 angstroms. Para soluciones poliméricas y algunos soles, en condiciones apropiadas, todo el sistema se transformará en una sustancia viscosa semisólida elástica y perderá fluidez. Este fenómeno se llama gelificación y el producto formado se llama gel o jalea.
"Aerogel" se refiere a un sistema disperso que es gaseoso, como nubes y niebla, "gel sólido" incluye cristales parecidos al humo y "gel líquido" es un coloide líquido, como el coloide de hidróxido férrico. .