¿Cuáles son los principios y procedimientos básicos para la preparación de anticuerpos monoclonales? ¿Cuál es el punto?

Bajo la estimulación del antígeno, los linfocitos B pueden diferenciarse y proliferar, adquiriendo la capacidad de secretar anticuerpos específicos contra el antígeno. La capacidad y el número de células B son limitados y no pueden seguir diferenciándose y proliferando, por lo que su capacidad para producir inmunoglobulinas es extremadamente pequeña. Las células B se fusionan con células de mieloma no secretoras para formar células de hibridoma, que luego se clonan. Esta célula de hibridoma clonada tiene tanto la capacidad de los tumores de crecer indefinidamente como la capacidad de los linfocitos B de producir anticuerpos específicos. Cultivando o inyectando dichas células de hibridoma clonadas en ratones, se puede obtener una gran cantidad de anticuerpos específicos únicos y de alto título. Esta tecnología se llama tecnología de anticuerpos monoclonales.

Proceso

1) Preparación de esplenocitos inmunes La mayoría de los animales utilizados para preparar anticuerpos monoclonales son ratones Balb/c de pura raza. El método de inmunización depende de la naturaleza del antígeno utilizado. El método de inmunización es el mismo que el de preparación de suero general, y también se puede utilizar el método de inmunización directa en el bazo.

2) Cultivo y cribado de células de mieloma. Antes de la fusión, las células de mieloma se deben cribar en un medio que contenga 8-AG para prevenir mutaciones celulares y restaurar la actividad de HGPRT (restaurar la actividad de HGPRT). 8-AG). Se cultivaron células de mieloma en frascos de cultivo celular con medio de cultivo de suero de ternera al 10% y el medio se cambió una vez 24 horas antes de la fusión para mantener las células de mieloma en la fase de crecimiento logarítmico.

3) La clave de la fusión celular:

Los errores técnicos en 1 suelen provocar fallos en la fusión. Por ejemplo, no se detectó ninguna respuesta inmune en los linfocitos del donante. Esto seguramente fracasará.

La principal causa de fracaso en los experimentos de fusión es la contaminación, y la clave para una fusión exitosa es proporcionar un ambiente limpio y técnicas operativas asépticas apropiadas.

4) Los clones positivos deben ser cribados lo antes posible. La primera prueba generalmente se realiza 10 días después de la fusión y pueden ocurrir falsos positivos demasiado pronto. El método de detección debe ser sensible, preciso, sencillo y rápido. El método de aplicación específico debe seleccionarse en función de la naturaleza del antígeno y la funcionalidad del anticuerpo monoclonal deseado. Los métodos comúnmente utilizados incluyen radioinmunoensayo, inmunoensayo ligado a enzimas e inmunofluorescencia. Entre ellos, el método ELISA es el más sencillo y el método RIA el más preciso. La detección de clones positivos debe realizarse varias veces y solo todos los clones positivos pueden determinarse como clones positivos para la amplificación.

5) Clonación La finalidad de la clonación es obtener una única línea celular de población. La clonación debe realizarse lo antes posible y examinarse repetidamente. Esto se debe a que las células del hibridoma iniciales son inestables y propensas a perder cromosomas. Se pueden obtener líneas celulares de hibridoma estables después de clonaciones repetidas. Existen muchos métodos de clonación, el método más utilizado es el método de dilución limitante.

(1) Micromanipulación: tomar células individuales bajo un microscopio y luego cultivarlas. Este método es complejo de operar, de baja eficiencia y no se usa comúnmente.

(2) Método de dilución limitante: después de diluir las células de hibridoma en la fase de crecimiento logarítmico con medio de cultivo, se siembra 1 célula por pocillo en una placa de cultivo. Después de que las células proliferan, se convierten en líneas celulares monoclonales. Agregue una cierta cantidad de células alimentadoras al primer clon. Dado que las células cultivadas clonalmente por primera vez no se pueden clonar, se requieren de 2 a 3 reclonaciones para obtener una línea celular monoclonal estable. Cabe señalar que durante cada proceso de clonación, todas las células significativas deben congelarse para una inspección repetida y evitar la pérdida de células significativas.

(3) Método del agar blando: Diluir las células del hibridoma hasta una determinada densidad y luego suspenderlas en agar. Las células en agar no pueden moverse libremente y no se mezclan entre sí, logrando así el propósito del cultivo unicelular. Pero este método no es tan bueno como el método de dilución limitante.

(4) Clasificación de células con láser fluorescente: utilice microesferas de látex fluorescentes recubiertas con antígenos para marcar las células de hibridoma y luego seleccione las células según la especificidad de la unión del antígeno a las células de hibridoma para el cultivo de células individuales.

6) Criopreservación y recuperación de células

7) Preparación de anticuerpos monoclonales a gran escala Las líneas celulares positivas seleccionadas deben prepararse lo antes posible, ya que a medida que aumenta el tiempo de cultivo, Contaminación, mayor probabilidad de pérdida de inclusión y muerte celular. Hay dos formas de preparar anticuerpos. Uno es el método de cultivo incremental, que consiste en cultivar células de hibridoma in vitro y aislar anticuerpos monoclonales del medio de cultivo. Este método requiere instrumentos y equipos especiales y generalmente utiliza medios de cultivo sin suero para facilitar la concentración y purificación de anticuerpos monoclonales. El método más utilizado es la inoculación intraperitoneal en ratones. Se seleccionaron ratones BALB/c o sus padres, y a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal norfitano o parafina líquida. Una semana después, se inocularon células de hibridoma en la cavidad intraperitoneal de los ratones.

Por lo general, la ascitis evidente aparece una semana después de la inoculación y se pueden recolectar de 5 a 10 ml de ascitis de cada ratón, a veces incluso más de 40 ml. La ascitis preparada mediante este método tiene un alto contenido de anticuerpos, que puede alcanzar varios miligramos o incluso decenas de miligramos por mililitro. Además, el líquido ascítico contiene menos proteínas impuras, lo que facilita la purificación de los anticuerpos.

Significado:

Se utiliza en experimentos posteriores de ciencias biológicas y tiene valor médico.

(1) Reacción de precipitación: Reacción de precipitación

(2) Prueba de aglutinación: Hemaglutinación

(3) Utilizar radioinmunoensayo para detectar complejos inmunes.

(4) Citómetro de flujo: utilizado para la tipificación y separación celular.

(5) Detección inmunológica, como 5) ELISA

(6) Biosensor BIAcore: se utiliza para detectar Ab-Ag o proteínas.

Afinidad.

(7) Método de transferencia Western

(8) Inmunoprecipitación:

(9) Cromatografía de afinidad: proteínas separadas.

Usa (10) perlas magnéticas para la separación celular

(11) Diagnóstico y tratamiento de enfermedades clínicas;