Aislamiento y cultivo de células primarias.
? Por lo tanto, es una excelente herramienta para experimentos con fármacos, especialmente los efectos de los fármacos sobre la viabilidad, estructura, metabolismo, toxicidad o destrucción de las células. Los métodos de cultivo primario comúnmente utilizados incluyen el cultivo en bloque de tejido y el cultivo de digestión.
Muchos laboratorios prefieren utilizar el cultivo en bloque de tejido para el cultivo primario porque el método es simple y las células son fáciles de cultivar. Especialmente en el miocardio cultivado, a veces se puede observar la pulsación de los bloques de tejido miocárdico. Después de que las células crezcan desde el borde del bloque de tejido, cubra la placa de cultivo o el frasco de cultivo y luego páselo.
1. Materiales del equipo
Incubadora, refrigerador, mesa de trabajo limpia/sala estéril, pajitas estériles, tubos de centrífuga, lámpara de alcohol, soporte para tubos de ensayo, frascos de cultivo, placas de Petri, líquido digestivo, líquido de cultivo básico, suero fetal bovino, solución de Hanks, solución de prueba de anticuerpos dobles, tijeras, pajitas y vasos pequeños.
2. Pasos de la operación
(1) En condiciones estériles, tome una cantidad adecuada de tejido para cultivar, colóquelo en un vaso de precipitados pequeño y enjuáguelo de 2 a 3 veces con una cantidad adecuada de solución de Hanks. Retire las manchas de sangre de la superficie del bloque de tejido.
(2) Utilice tijeras para ojos para cortar repetidamente el bloque de tejido en trozos pequeños de 0,5 ~ 1 mm3.
(3) Lavar repetidamente con solución de Hanks hasta que el líquido ya no esté turbio. A medida que el bloque de tejido se hunde, incline el vaso e intente pipetear la solución de Hanks.
(4) Lavar nuevamente con medio de cultivo que contenga suero 20 inactivado y solución de doble anticuerpo (penicilina 200 U/ml, estreptomicina 200 μg/ml), chuparlo hasta secarlo con una pipeta y agregar 5 ml de suero 20. que contiene líquido de cultivo.
(5) Utilice una pipeta con forma de codo para aspirar pequeños trozos de tejido, colóquelos uniformemente en la superficie interior de la placa de cultivo y succione el exceso de líquido de cultivo en la distancia entre pequeños trozos de tejido. Debe ser de 0,5 cm y taparlo. Ponlo en la placa de Petri, márcalo y colócalo en una incubadora de CO2 a 37 °C.
(6) Después de 2 a 4 horas, agregue lentamente una pequeña cantidad del medio de cultivo mencionado anteriormente que contiene 20 suero y una solución de doble anticuerpo (100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina) al medio de cultivo. en la mesa de trabajo limpia. En un recipiente se sumergen los trozos de tejido en el medio de cultivo.
(7) Mueva suavemente la placa de cultivo y el bloque de tejido a la incubadora de CO2. No se requiere observación a menos que existan circunstancias especiales. Después de 1 a 2 semanas, se puede observar que las células crecen desde el borde del bloque de tejido para formar un halo de crecimiento.
(9) En términos generales, si no hay un cambio evidente en el medio de cultivo, basta con cambiar el medio de cultivo cada 1 semana. Cuando las células cubren la superficie interna de la placa de cultivo, se pueden subcultivar.
3. Cuestiones que necesitan explicación y atención
(1) Si se utiliza una botella de cultivo en lugar de una placa de Petri, después de inocular el bloque de tejido en la pared inferior de la botella de cultivo. , gire suavemente el frasco de cultivo. Coloque el fondo del frasco en la parte superior, tape el frasco y colóquelo suavemente en una incubadora de CO2 a 37 °C. Después de 2 a 4 horas, saque el frasco de cultivo y abra la tapa del frasco. un banco de trabajo limpio, manteniendo aún el bloque de tejido en la parte superior. Agregue una cantidad adecuada del medio de cultivo anterior a la pared de la botella opuesta al bloque de tejido. Luego, invierta suavemente la botella de cultivo para que los trozos de tejido queden sumergidos en el medio de cultivo. Tape la botella y colóquela nuevamente en la incubadora de dióxido de carbono para continuar con el cultivo.
(2) Deseche el tejido libre en la superficie de la placa de cultivo.
(3) Si utiliza una botella de cultivo de vidrio en lugar de una botella de cultivo de plástico nueva, es mejor aplicar colágeno de cola de rata en el fondo del vidrio. Esto no solo facilitará la adhesión de los bloques de tejido. , pero también hace que las células sean más estables.
(4) Este método es adecuado para el cultivo de diversos tejidos y los operadores pueden modificarlo según sus propias necesidades experimentales y tipos de células.
Existen dos diferencias principales entre este y el método de cultivo en bloque de tejido anterior.
? punto. Primero, el bloque de tejido debe tratarse con una preparación enzimática (la más comúnmente utilizada es tripsina) para eliminar la matriz intercelular y separar las células entre sí para formar una suspensión celular, donde los dos tipos de células crecen en su mayoría en una sola capa;
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La ventaja de este método es que una sola capa de células puede absorber más fácilmente nutrientes y excretar metabolitos, por lo que crece más rápido y puede aplicarse rápidamente a la investigación experimental. La desventaja es que los pasos son bastante complicados y pueden conducir fácilmente a la contaminación; no se maneja con cuidado. Además, el proceso de digestión debe ser correcto, de lo contrario provocará ciertos daños en las células.
1. Procedimientos operativos
(1) En condiciones estériles, tome aproximadamente 1 cm3 de tejido para cultivar, colóquelo en una placa de Petri o en un vaso de precipitados y lávelo tres veces con agua adecuada. Solución de Hanks, para eliminar manchas de sangre y tejido conectivo en la superficie del bloque de tejido.
(2) Utilice tijeras afiladas para cortar repetidamente el bloque de tejido para obtener trozos pequeños de aproximadamente 0,5 mm × 1 mm.
(3) Enjuague varias veces con la solución de Hanks y luego el bloque de tejido se hundirá y succionará el líquido de Hanks.
(4) Utilice una pequeña cantidad de solución de Hanks para preabsorber el pequeño trozo de tejido en un vaso de precipitados cónico con un agitador magnético estéril y luego agregue de 15 a 30 ml de solución de digestión con tripsina.
(5) Tapar bien el vaso cónico con un tapón de goma y sellarlo con papel de aluminio. Luego pasarlo a un agitador electromagnético previamente colocado en una incubadora a 37°C.
(6) Encienda el interruptor de encendido del mezclador, deje que el mezclador gire, cierre la incubadora y permita la digestión con tripsina.
(7) Durante el proceso de digestión, deje caer el material digerido en un portaobjetos de vidrio a intervalos regulares y obsérvelo bajo un microscopio óptico para comprobar si las células están dispersas en células individuales. Si la mayoría de las células se han dispersado, agregue inmediatamente una cantidad adecuada de solución de Hanks para detener la digestión. Por lo general, la digestión tarda entre 10 y 20 minutos.
(8) Primero filtrar con una malla de acero inoxidable de 100μm para eliminar bloques de tejido no digeridos o grandes grupos de células (si se obtienen menos células, se pueden continuar digiriendo estos bloques de tejido para obtener más células). Luego filtrar a través de una malla de acero inoxidable de 20μ.
(9) Centrifugar el filtrado obtenido a baja velocidad (500~1000 rpm) durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Centrifugar y lavar con solución de Hanks 1 a 2 veces y finalmente agregar medio de cultivo que contenga suero y agitar uniformemente para preparar una suspensión celular.
(10) Utilice una tabla de contar para determinar la concentración de la suspensión celular. Por lo general, se siembran 1 × 105 ~ 3 × 105 células en una botella o plato de cultivo.
2. Cuestiones que necesitan explicación y atención
(1) La enzima que se utiliza para la digestión depende de las células cultivadas. Además de la tripsina, la colagenasa tipo 1 se usa comúnmente para digerir las células de sostén, las células del músculo liso vascular y las células endoteliales. La colagenasa tipo II digiere las células de adenohipófisis de rata.
(2) Si no hay malla de acero inoxidable, se pueden usar cuatro capas de gasa, pero la gasa debe esterilizarse previamente con alta temperatura y alta presión.
(3) Estrictamente hablando, el cultivo primario se refiere a células que no han sido pasadas, pero en el trabajo real, las células dentro de 10 generaciones a menudo se usan como células cultivadas primarias, porque las células en este momento son básicamente Mantiene características biológicas originales.
(4) A partir de los pasos operativos del cultivo primario, no es difícil ver que las células primarias contienen una variedad de componentes celulares, es decir, pertenecen a una población heterogénea. Al analizar los resultados, no deben olvidarse de este factor.