¿Cuáles son los pasos básicos para la secuenciación del terminador didesoxi?

Tomando como ejemplo la secuenciación de ADN bicatenario, los pasos básicos del método de terminación terminal didesoxi incluyen: preparación de una plantilla bicatenaria desnaturalizada, extensión y reacción de terminación.

1. Preparación de la plantilla bicatenaria desnaturalizada

① Tome 1,5 ml de líquido de cultivo en fase de crecimiento logarítmico (que contiene la plantilla de plásmido recombinante del ácido nucleico viral que se va a analizar) y Se centrifugó para eliminar el sobrenadante, la colonia bacteriana se resuspendió en 150 ml de tampón tris/glucosa y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos.

②Añadir 300ml de SDS al 1% y NaOH 0,2mol/L, mezclar vertiendo unas 15 veces, dejar a temperatura ambiente durante 15 minutos, añadir 25ml de acetato de sodio 3mol/L (pH 4,5), y mezclar vertiendo unas 15 veces. Colocar en baño de hielo durante 45 minutos y centrifugar.

③ Transferir 650ml de sobrenadante a un tubo nuevo, agregar 650ml de alcohol isopropílico, mezclar bien, dejar reposar a temperatura ambiente durante 65438±00 minutos, centrifugar durante 5 minutos, desechar el alcohol isopropílico y secar el precipitar al vacío.

④Resolver el ADN con 125 ml de TE (pH 8,0), añadir 375 ml de LiCl de 4 mol/l, mantener en baño de hielo durante 20 minutos y centrifugar a 4 ℃ durante 5 minutos.

⑤ Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, extraer con fenol saturado, luego extraer con cloroformo, agregar 2 veces la cantidad de alcohol isopropílico, precipitar a temperatura ambiente por 30 minutos, centrifugar por 5 minutos, desechar el líquido sobrenadante.

⑥ Lavar el precipitado con etanol al 70% enfriado con hielo, centrifugar durante 5 minutos, descartar el sobrenadante y secar, y redisolver el precipitado con 50 ml de tampón. El contenido de ADN plasmídico se midió usando un espectrofotómetro UV.

⑦ Tome 0,2 mg de ADN plasmídico, ajuste el volumen a 9 ml, agregue 1 ml de NaOH de 2 mol/L y EDTA de 2 mmol/L, déjelo a temperatura ambiente durante 5 minutos, agregue 2 ml de acetato de sodio de 30 mol/L (pH 4.5) y 8 ml de agua.

⑧Añadir 6 ml de etanol absoluto helado, mezclar y colocar en un baño de hielo seco/etanol durante 65438±05 minutos, centrifugar a 4°C durante 5 minutos, desechar con cuidado el sobrenadante y enjuagar con Etanol al 70% enfriado con hielo Lavar el sedimento, centrifugar durante 5 minutos y desechar con cuidado el sobrenadante, escurrir el sedimento al vacío y volver a disolver el sedimento con tampón TE.

2. Extensión y terminación de la reacción

Tomemos la reacción de terminación de cadena didesoxi usando la ADN polimerasa T7 como ejemplo.

① Tome cuatro tubos de centrífuga pequeños de 0,5 ml y etiquételos como G, A, T y C respectivamente. Agregue 7 ml de plantilla de ADN bicatenario desnaturalizado (1 y 2 mg respectivamente) a cada tubo y agregue 1 ml. de oligonucleótido Mezclar el cebador ácido con 2 ml de tampón de secuenciación 5X, incubar a 65 °C durante 2 minutos y enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

②Agregue 1 ml de 0,1 mol/L de DTT, 2 ml de mezcla de dNTP de 1,5 mol/L, 0,5 ml de 32P dATP y 2 ml (2 UI) de mezcla de ADN polimerasa T7 en cada tubo de ensayo y déjelo a temperatura ambiente durante 5 minutos.

③ Según la etiqueta, añadir 3 ml de una de las cuatro mezclas de terminación ddNTP a cada tubo de ensayo.

④ Tras una breve centrifugación, incubar a 37°C durante 5 minutos.

⑤Agregue 5 ml de tampón de carga de formamida, caliente a 80 °C durante 2 minutos, cargue la muestra y colóquela rápidamente en un baño de hielo. Tome 3 ml de cada muestra y cárguelo para electroforesis.

⑥Leer la secuencia de nucleótidos de la cadena sintética.

Datos ampliados

Precauciones para la electroforesis de reacción de secuenciación y la lectura de secuenciación durante reacciones de extensión y terminación;

(1) Los geles de gradiente se procesan de acuerdo con la preparación de gel de poliacrilamida ordinaria método.

(2) Agregue cada muestra en el orden de G, A, T, C, 1 ml de muestras en cada carril de G, A y T, y 1,5 ml de muestra en el carril C.

(3 ) Después de cargar la muestra, aplique una presión de 1700 V para la electroforesis y determine el tiempo de electroforesis en función de la migración de los tintes azul de bromofenol y azul de xileno en la muestra.

(4) Después de la electroforesis, enjuague con ácido acético glacial a 65438 ± 00 ℃ durante 30 minutos para eliminar la urea.

(5) Después de secar a 60°C u 80°C durante 30 minutos, leer la secuencia mediante autorradiografía.

Enciclopedia Baidu: método de terminación de cadena didesoxi