Métodos y precauciones de aislamiento y extracción para células primarias

Por ejemplo, material de biopsia.

Las células establecen un crecimiento in vitro. Estas células experimentan poca proliferación poblacional, por lo que pueden ser mejor representativas de su tejido de origen que las líneas celulares con tumores en serie o inmortalización artificial. Componentes funcionales clave que hacen que las células primarias sean más representativas de los modelos in vivo.

El aislamiento de células primarias se refiere al proceso de obtención de células diana del tejido después de dispersar el tejido en una suspensión celular. La obtención de células primarias de alta pureza y alta viabilidad es uno de los factores clave para el éxito de muchos experimentos con células. Existen muchos métodos para el aislamiento primario de células: centrifugación en suspensión, método de bloqueo directo de tejido, digestión enzimática, digestión no enzimática, dispersión mecánica, etc.

En el cuerpo humano o animal

o tejido embrionario

Debido a la estrecha combinación de varias células, no es propicio para el crecimiento y la reproducción de cada célula en cultivo in vitro. Incluso con un bloque de tejido de 1 mm3, es probable que sólo una pequeña cantidad de células periféricas sobrevivan y crezcan. Si se desea obtener una gran cantidad de células, el bloque de tejido existente debe estar suficientemente disperso para disociar las células. Los métodos más utilizados son los siguientes:

1. Método de aislamiento de células en suspensión

Si el material tisular proviene de suspensión de sangre, líquido amniótico, derrame pleural o ascitis, el método más sencillo es. 1000r/ Centrifugar a baja velocidad durante 10 minutos. Si la suspensión es grande, el tiempo de centrifugación se puede extender adecuadamente, pero la velocidad no debe ser demasiado alta y el tiempo de demora no debe ser demasiado largo para evitar apretar o dañar mecánicamente las células. El sedimento centrifugado se lavó dos veces con PBS libre de calcio y magnesio y una vez con medio. Después de ajustar la concentración celular apropiada, las células se cultivaron en matraces. Si selecciona algunas células en la suspensión, a menudo se usa la solución de capas de células centrifugadas, porque debido a la diferente gravedad específica de varias células, se pueden formar diferentes capas en la solución de capas de células centrifugadas, de modo que las células objetivo se puedan recolectar según sea necesario. .

2. Método de separación de materiales de tejido sólidos

Para materiales de tejido sólidos, debido a la estrecha combinación entre las células, para dispersar completamente las células en el tejido y formar una suspensión celular. , se puede utilizar la separación mecánica. Método de dispersión.

Craqueo físico

Así como digestión y separación.

Un

Método de dispersión mecánica

Si el contenido de fibra en el material es muy pequeño, como tejido cerebral, puedes usar tijeras para cortar algo de tejido embrionario. y soplar con una pajita. Disociar las células del tejido o colocar el tejido completamente cortado en una jeringa.

Utiliza una aguja del tamaño 9

para que las células puedan ser extraídas con la aguja, o exprimidas con un objeto contundente dentro de una malla de acero inoxidable.

Jeringuilla común con extremo romo

Las células se extruyen de la rejilla. Aunque este método es simple y rápido para separar células, causa un gran daño mecánico al tejido y tiene un efecto de dispersión celular deficiente. Este método sólo es adecuado para el tratamiento de tejidos blandos con un pequeño componente fibroso.

II

Método de digestión y separación

La digestión del tejido consiste en cortar el tejido en trozos más pequeños.

Todavía está blando

Utiliza la acción bioquímica de las enzimas y acciones químicas no enzimáticas para aflojar aún más la estructura de puente entre las células, haciendo que el coágulo sea espeso y floculante. En este momento, se utilizan métodos mecánicos para dispersar los coágulos soplando con una pipeta o agitando electromagnéticamente o agitando en un matraz agitador, de modo que los coágulos celulares puedan dispersarse completamente y obtener una suspensión celular de una pequeña cantidad de grupos de células y una gran cantidad. Se puede hacer el número de celdas individuales. Después de la inoculación y el cultivo, las células pueden crecer fácilmente en la pared.

Pasos de operación del método de digestión y aislamiento

1

Corte el bloque de tejido en pedazos con un tamaño de visualización de 1 ~ 5 mm3.

2

Añade líquido al plato para enjuagar el tejido dañado.

O matraz Erlenmeyer.

Lavar 2-3 veces con PBS sin calcio y magnesio.

Adoptar el método de asentamiento natural inclinado.

.

Tres

Añade jugo digestivo para la digestión.

Tripsina o colagenasa o EDTA

Colocar al baño maría a 37°C durante un tiempo adecuado.

Agita 1 o 2 veces entre medias.

Si el bloque de tejido se vuelve esponjoso, se puede terminar. Si el cambio no es significativo, se puede reponer el jugo digestivo una vez y la digestión continúa hasta que se vuelve esponjosa y floculante. El tiempo de digestión con tripsina no debe ser demasiado largo.

Cuatro

Desechar el jugo digestivo inclinándolo para que se asiente de forma natural o centrifugando a baja velocidad.

V

Enjuague: agregue lentamente medio de cultivo que contenga iones de calcio y magnesio a lo largo de la pared de la botella para detener la reacción de digestión, enjuague 2-3 veces y luego agregue el medio de cultivo completo.

Seis

La dispersión mecánica utiliza pipeta soplando o agitando. Después de que las células estén completamente dispersas, filtre con una gasa o 3-4 capas de gasa estéril y cultive en una botella. Si los requisitos no son altos, puede inclinarlo para que se asiente naturalmente durante 5 a 10 minutos y luego absorber la suspensión celular superior para el cultivo en matraz.

Tenga en cuenta lo siguiente:

1

El bloque de tejido debe lavarse 2 o 3 veces para eliminar los efectos de los iones de calcio y magnesio en el tejido y suero sobre tripsina y efecto inhibidor de EDTA.

2

La concentración de tripsina no debe ser demasiado alta y el tiempo de acción no debe ser demasiado prolongado para evitar efectos tóxicos.

Tres

Después de la digestión, el tejido no sólo debe desechar el jugo digestivo en la medida de lo posible para evitar la toxicidad, sino también moverlo suavemente para evitar perder células grandes con el enrojecimiento.

3. Método de digestión enzimática

1) Esterilidad

Asegurar el uso de equipos, reactivos y técnicas estériles para recolectar y procesar tejidos. Utilice equipo de protección personal para evitar la contaminación. Filtre de forma estéril todas las enzimas y reactivos utilizando membranas de 0,22 micras.

2) Corte

Cortar la muestra de tejido en trozos pequeños con unas tijeras o bisturí esterilizados.

Normalmente de 2×4 mm.

A continuación, los comprimidos se colocan en el tampón, medio de cultivo o solución salina seleccionado.

3) Añade enzimas

Lava el tejido tres veces para eliminar el exceso de proteínas sanguíneas, luego añade la enzima de tu preferencia, como colagenasa, proteasa, papaína o tripsina. Generalmente alrededor de 0,5 mg/ml ~ 1,5 mg/ml de enzima.

4) Incubación

Incubar la muestra de tejido a su temperatura óptima, normalmente a 37°C durante 30 a 90 minutos. Mezcle o agite suavemente la muestra con regularidad.

5) Lavar

Dispersar las células pipeteando suavemente.

También conocida como molienda

A continuación, la suspensión celular se filtra mediante una malla fina. Pellet las células y decantar el exceso de líquido que contiene enzimas y lavar dos o tres veces. También se pueden utilizar soluciones de lavado que contengan FBS, BSA u otros inhibidores para prevenir la digestión enzimática.

6) Análisis

Suspender las células en un medio de cultivo o tampón adecuado y luego medir cuantitativamente el rendimiento y la viabilidad celular. Este es un paso importante en el proceso de aislamiento celular para que puedas evaluar los resultados de la técnica de disociación. La mayoría de los investigadores utilizan un hemocitómetro para medir el rendimiento celular y un tinte diazo azul tripán para medir la viabilidad celular.