Experimento de cultivo primario
Fármacos: medio de cultivo (RPMI1640 o DMEM), suero de ternera, tripsina al 0,125%, solución de Hanks, alcohol al 75%, anticuerpos dobles (penicilina y estreptomicina).
Instrumento (consultar galería de instrumentos): Incubadora de CO2. Microscopio invertido, mesa de trabajo limpia, agitador magnético, centrífuga. 1. Tomando como ejemplo el ratón embrionario, mate a la ratona preñada tirando de su columna cervical, sumérjala en alcohol al 75% durante unos segundos para desinfectarla, coloque la ratón preñada en un plato de cera y fíjela con un alfiler. Utilice instrumentos quirúrgicos para separar la piel y el tejido muscular capa por capa y abrir la cavidad abdominal. Tenga en cuenta que se utilizan diferentes instrumentos estériles en diferentes niveles anatómicos. Finalmente, se extrajo el útero bicorne y se colocó en un recipiente esterilizado.
2. Enjuagar 3 veces con solución de Hanks, cortar el útero y extraer el embrión. Retire el útero, la sangre, la fascia y otros tejidos.
3. Utilice tijeras de codo para cortar tantos embriones como sea posible, con cada bloque de tejido de menos de 1 mm3. Durante el funcionamiento, mantenga la cubierta de la placa medio cubierta tanto como sea posible para evitar que caiga polvo en el aire y contamine el tejido. Luego lavar con solución de Hanks 2-3 veces y precipitar de forma natural. Aspirar el sobrenadante con una pipeta. Los siguientes métodos se pueden realizar de dos formas: digestión y cultivo en bloque de tejido.
4. Si se utiliza el método de digestión, colocar el bloque de tejido en un matraz Erlenmeyer, añadir 10-30ml de tripsina al 0,125% y digerir con agitación magnética a 37°C durante más de 20 minutos. Luego agregue una pequeña cantidad de suero para detener la digestión. Colar a través de varias capas de gasa esterilizada. Tomar el filtrado y centrifugar a 800 rpm durante 5-65.438±00 minutos para recoger las células. Deseche el sobrenadante, agregue medio de cultivo que contenga anticuerpos dobles y colóquelo en una botella de cultivo para cultivo.
5. Si se cultiva el bloque de tejido, no realice el paso 4. Agregue unas gotas de suero al bloque de tejido y luego use una pipeta de codo para aspirar la suspensión del bloque de tejido. Utilice botellas de cultivo pequeñas para distribuirlas una por una, asegurándose de que el fondo de la botella quede plano. Voltee el frasco y colóquelo en una incubadora a 37°C durante 2-3 horas. Después de que el bloque de tejido esté ligeramente seco y firmemente adherido a la pared de la botella, voltee suavemente la botella, agregue 4-5 ml de medio de cultivo desde las esquinas, de modo que las células estén en contacto con el medio de cultivo y colóquelo. en la incubadora para continuar con el cultivo.