Biblioteca inmune unicelular: principio de reordenamiento del gen TCR y método de construcción de la biblioteca de secuenciación TCR
Serie de métodos y principios de secuenciación unicelular:
El repertorio inmunológico (IR) se refiere a todas las células B funcionalmente diversas y a las células B en el sistema circulante de un individuo en un momento específico. En este momento, la suma de células T juega un papel vital en diversas enfermedades, como enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, cáncer, etc. Es por eso que el repertorio inmunológico siempre ha sido el foco de la investigación en diversos campos.
La inmunidad es el mecanismo de defensa más importante en humanos y vertebrados, produciendo anticuerpos específicos tras la exposición a antígenos extraños. El reconocimiento de antígenos mediado por células T depende de la interacción de los receptores de células T (TCR) con las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) del antígeno. Los TCR son heterodímeros muy diversos compuestos de cadenas alfa y beta (αβ TCR) expresadas por la mayoría de las células T o por células T en sangre periférica (1-5) y células T que se encuentran en sitios de la mucosa. Las células expresan la cadena γδ (γδ TCR). . Hay aproximadamente de 3000 a 30 000 moléculas de TCR en la superficie de cada célula T.
La suma de los TCR de todas las células T se convierte en el perfil TCR (perfil TCR). A medida que avanza la enfermedad, el perfil de TCR cambia mucho. Por lo tanto, los investigadores prestan cada vez más atención al estado del espectro inmunológico en diferentes enfermedades, como cáncer, autoinmunidad, inflamación, enfermedades infecciosas, etc.
La cadena TCR consta de una región variable (región V) y una región constante (región C) para el reconocimiento de antígenos. Los genes que codifican las cadenas α y δ del TCR humano se encuentran en los cromosomas 14 y 7 respectivamente. La cadena α está codificada por múltiples genes V variables, de unión J y C (que codifican la región C constante), mientras que la cadena β de TCR está codificada por los genes V, J, C y D de diversidad. Los loci genéticos como V, D, J y C tienen cada uno alelos diferentes.
El reordenamiento del gen TCR, también conocido como reordenamiento del ADN o recombinación de células somáticas, se refiere al hecho de que durante la diferenciación y maduración de las células T en el timo, los genes de la región V en el estado de la línea germinal se separan por separado. , segmentos de genes transcripcionalmente inactivos El proceso de unión a un gen activo completo con función de transcripción bajo la acción de una recombinasa específica.
Durante el reordenamiento, el gen Vβ primero sufre una conexión D y J (un determinado segmento -D está conectado a un determinado segmento -J), y luego una conexión V y DJ (el segmento DJ conectado está conectado a un cierto segmento -V) Forme un clip V|DJ. Esto produce un gen Vβ transcripcionalmente activo (gen V|DJ), que luego se conecta al gen de la región C para formar un gen funcional de cadena β completa. Una reordenación exitosa del gen Vβ puede inducir una reordenación del gen Vα. El gen Vα no tiene segmento D y conecta directamente V y J (un determinado segmento V está conectado a un determinado segmento J) para formar un segmento VJ. El gen Vα transcripcionalmente activo reordenado (gen VJ) se conecta luego al gen de la región C para formar un gen funcional de la cadena α completa (la especificidad del TCR está determinada por los segmentos VJ y VDJ de la cadena α y la cadena β, respectivamente).
El reordenamiento del gen de la región V del TCR solo ocurre en la etapa temprana de la diferenciación de las células T, porque la recombinasa específica solo existe en la etapa temprana y su actividad es estrictamente limitada en el tiempo y específica de las células del tejido azul. Por lo tanto, las células T sólo pueden sufrir un reordenamiento genético eficaz durante el proceso de diferenciación y maduración, lo que garantiza que un clon de células T sólo pueda expresar un TCR específico y mostrar sólo una especificidad de reconocimiento de antígeno.
Tras la reordenación genética de las dos cadenas, se pueden formar decenas de millones de moléculas de TCR con diferentes especificidades, que pueden reconocer una variedad de antígenos en el medio ambiente.
Es esta diversificación de TCR causada por reordenamientos aleatorios la que hace que el sistema inmunológico sea más rápido, preciso y eficaz a la hora de identificar y eliminar antígenos exógenos específicos.
La sobrediversidad es también el mayor problema en la secuenciación inmunitaria actual. En teoría, el reordenamiento de VDJ puede producir entre 1015 y 1020 tipos de clones diferentes, pero en realidad sólo hay alrededor de 1013 tipos de clones diferentes. Esto significa que los reordenamientos de VDJ aparentemente aleatorios son en realidad regulares y están sujetos a diversas condiciones.
La recombinación de regiones variables con segmentos genéticos constantes produce transcritos de cadenas de TCR funcionales. Este proceso da como resultado una fuerte diversidad combinatoria (dependiendo de qué región genética se recombinará) y de unión (cuántos nucleótidos se agregarán/eliminarán), lo que resulta en un perfil de TCR grande y altamente variable y, en última instancia, en la identificación de una gran cantidad de perfiles de TCR. antígenos. La diversidad se logra emparejando cadenas alfa y beta o gamma y delta para formar TCR funcionales.
Cada cadena TCR contiene tres bucles hipervariables, denominados regiones determinantes de la complementariedad CDR1-3 (región determinante de la complementariedad 1-3). CDR1 y CDR2 están codificados por el gen V y son fundamentales para la interacción entre los complejos TCR y MHC. Sin embargo, CDR3 está codificada por la región de conexión entre V y J o D y J, por lo que el grado de variación de CDR3 es mayor. Dado que CDR3 es la región de TCR en contacto directo con el antígeno, CDR3 juega un papel muy importante en la interacción entre TCR y los complejos péptido-MHC.
Por tanto, CDR3 es una región clonal común de las células T, a menos que las células T se amplifiquen de la misma forma, en términos generales, es casi imposible que las células T expresen la misma secuencia de CDR3.
Chromium Next GEM Single Cell 5' Kit v2
La secuenciación 10X V(D)J es básicamente la misma que el proceso de construcción de la biblioteca de secuenciación del transcriptoma, los cuales requieren la construcción microfluídica de un solo aceite celular. Sistema de reacción acuosa, el proceso de transcripción inversa de ARNm en ADNc y amplificación. A diferencia de la secuenciación del transcriptoma unicelular 10X convencional, que coloca el código de barras y las secuencias UMI en el extremo 3', la secuenciación V(D)J coloca el código de barras y las secuencias UMI en el extremo 5'.
Después de la amplificación, el ADNc de la muestra con transcripción inversa se puede dividir en dos partes. Una parte se utiliza para la secuenciación del ARNc del extremo 5' y la otra parte se amplifica con cebadores enriquecidos para V(D). )J secuenciación de secuencias.
Después de la reacción GEM-RT, se utilizan perlas magnéticas para enriquecer y purificar el ADNc de la primera hebra con un código de barras 10X, y luego se amplifica por PCR el ADNc.
El producto amplificado en este paso se puede utilizar para construir bibliotecas de células T y B (Pasos 3-4) y una biblioteca de expresión génica 5' (Paso 5) al mismo tiempo.
Amplificación La secuencia V(D)J de longitud completa obtenida se digerirá en fragmentos de diferentes longitudes. Debido a que cada secuencia V(D)J tiene muchas copias amplificadas por PCR y estas copias tienen la misma etiqueta UMI, cada secuencia V(D)J obtendrá un conjunto de lecturas de secuenciación (identificadas de la misma fuente a través de UMI).