¿Cuál es el principio del espectrofotómetro?
En los últimos años, el análisis espectrofotométrico UV-visible se ha utilizado ampliamente, no sólo para la identificación y análisis estructural de sustancias, sino también para la determinación de determinadas sustancias.
Las técnicas de espectroscopia se pueden utilizar para:
Determinar la composición de una sustancia midiendo su espectro de absorción o emisión.
La cantidad de una sustancia sola o mezclada con otras sustancias se determina midiendo la intensidad de la señal en la longitud de onda adecuada.
El progreso de una reacción se puede seguir midiendo la cantidad de sustrato que desaparece o la cantidad de producto que aparece en función del tiempo.
1. Espectrofotómetro UV-visible Es una tecnología que sólo mide la radiación absorbida por una sustancia dentro del rango de aplicación de la luz visible y el espectro ultravioleta. Entre ellos, el espectrofotómetro se puede utilizar para medir con precisión el valor de absorción de una longitud de onda específica, mientras que el colorímetro es un instrumento de medición relativamente simple. Su principio es utilizar un filtro para medir una banda más amplia (como la luz verde, la luz roja o la luz roja). luz visible en luz visible).
Ley de absorción de la luz:
Existen dos leyes básicas para la absorción de la luz por una solución:
El valor de absorción de la luz que pasa a través de la solución es exponencialmente relacionado con el número de moléculas del soluto absorbente (es decir, concentración de soluto [C]).
El valor de absorción de la luz que pasa a través de una solución está relacionado exponencialmente con la longitud del camino L a través de la solución absorbente.
Estas dos leyes están contenidas en la relación Beer-Lambert. Suelen expresarse mediante la densidad óptica de la luz incidente (Io) y de la luz emergente (I):
ε donde ε es la constante del material absorbente y la longitud de onda, denominada coeficiente de absorción o coeficiente de absorción, [ C] La unidad es mol/L o G/L, y la unidad de L es ml. Esta fórmula es útil porque la mayoría de los espectrofotómetros están diseñados para medir directamente valores log10(Io/I) (a) o valores de extinción (e) (los libros de texto más antiguos pueden haber usado esta terminología obsoleta: A y c tienen una relación lineal, y el valor de absorción generalmente se expresa como un subíndice, como A550 que indica el valor de absorción a 550 nm. La relación de luz que pasa a través de la solución se llama transmitancia (T), que se puede obtener a partir de la relación entre la luz emergente y la luz incidente.
Valor de absorción (a) (absorbancia) - derivado de la fórmula:
Transmitancia de luz (T) - generalmente expresada como porcentaje: T=(I/Io)× (I ) Colorímetro El colorímetro se utiliza para medir los componentes principales de objetos y soluciones de prueba de colores obvios, como los glóbulos rojos en la sangre. También se pueden agregar reactivos a los objetos de prueba para formar productos coloreados (cromóforos), como el método de la ninhidrina. contenido de ácido.
La fuente de luz suele ser una bombilla de filamento de tungsteno, que se enfoca mediante una lente convexa para producir un haz de luz paralelo que pasa a través de una muestra de vidrio o celda llena de solución y luego pasa a través de una filtro de color a un detector fotoeléctrico. El detector genera un potencial proporcional a la densidad de la luz que incide sobre la fotocélula, y la señal de la fotocélula se amplifica y luego se transmite a un galvanómetro o lector digital.
Uso de colorímetros. :
① Encienda la alimentación para estabilizar el instrumento y deje que la lámpara se precaliente durante al menos 5 minutos antes de usarla (2) Seleccione un filtro con un color complementario al sustrato ③ Ajuste cero (control en blanco; ajuste cero); ④ Ajustar la sensibilidad; ⑤ Muestra de análisis y solución estándar; ⑥ Dado que diferentes cubetas tienen diferentes características de absorción de luz y espesor de pared de la copa, para mejorar la precisión, se utiliza la misma cubeta en el mismo experimento y la orientación en el la cubeta es la misma; ⑦ Cada muestra Limpie la cubeta antes de la medición; ⑧ Realice mediciones repetidas en la misma solución para probar la repetibilidad del colorímetro; ⑨ Utilice soluciones estándar para dibujar una curva estándar;
Dado que la luz filtrada por la mayoría de los filtros tiene una banda muy ancha, el colorímetro no se puede utilizar para medir un compuesto, ni para distinguir dos compuestos con propiedades de absorción muy similares en una solución mixta. . Las fotocélulas utilizadas en los colorímetros tienen un coeficiente de variación de aproximadamente 0,5, lo que las hace inadecuadas para trabajos que requieren alta precisión. Con este instrumento más simple, debido a la aleatoriedad de las unidades de escala de medición logarítmica del instrumento, incluso si la sensibilidad/escala del instrumento se ajusta al punto de control cero, el valor obtenido de un instrumento no se puede comparar con el valor obtenido de otro instrumento. Los valores medidos en el instrumento no son directamente comparables, ni pueden compararse directamente entre diferentes configuraciones del mismo instrumento. Los colorímetros no son adecuados para la cuantificación de longitudes de onda específicas.
(2) Espectrofotómetro UV/visible El dispositivo básico del espectrofotómetro UV/visible utiliza una lámpara de tungsteno de alta intensidad como fuente de luz, que se puede ajustar en el rango de luz visible (400-700 nm). . Las lámparas de deuterio se utilizan para mediciones espectrofotométricas UV (200-400 nm). Se debe utilizar una taza estacional cuando se utilizan lámparas de deuterio, ya que los rayos ultravioleta no pueden atravesar el vidrio.
La razón por la que un espectrofotómetro es superior a un colorímetro es que utiliza una rejilla de difracción para convertir la luz policromática de una fuente de luz en un haz paralelo monocromático. De hecho, la luz producida por esta luz monocromática no es luz de una determinada longitud de onda, sino luz con un ancho de banda muy estrecho. Esta es una característica importante del espectrofotómetro porque determina la longitud de onda utilizada para las mediciones de absorción: el ancho de banda de la espectroscopia ordinaria. el fotómetro es de 5 ~ 10 nm. El ancho de banda del instrumento utilizado para el estudio es menor que 1 porque el ancho del espacio de la rejilla afecta el ancho de banda, que disminuye a medida que disminuye el ancho del espacio de la rejilla. Para obtener datos precisos en una longitud de onda específica, se debe utilizar el ancho de espacio más pequeño posible. Sin embargo, reducir el ancho del espacio también reduce el brillo y la relación señal-ruido que llega a la pantalla. El grado en que se puede reducir el ancho del espacio depende de la sensibilidad y estabilidad del sistema de detección/amplificación.
La trayectoria óptica de la cubeta utilizada por la mayoría de los espectrofotómetros UV/visible es de 65438±00 nm. Los vasos de plástico desechables son adecuados para medir soluciones de agua y etanol en el rango de luz visible. La producción de cubetas de vidrio requiere estándares más estrictos, por lo que las cubetas de vidrio deben usarse en investigaciones precisas, especialmente cuando el valor de absorción de la solución es muy bajo (
Antes de la medición, las cubetas deben estar limpias y libres de rayones. , la superficie exterior debe estar seca y el líquido debe mantenerse a la altura adecuada y colocarse en la posición correcta en la cubeta. Las proteínas y los ácidos nucleicos de las muestras biológicas pueden depositarse en la superficie interior de la cubeta de vidrio/acero inoxidable. así que úselo. Sumerja una bola de algodón en acetona para limpiar la precipitación en la cubeta o sumérjala en 1 mol/L de ácido nítrico durante la noche. Las soluciones corrosivas y tóxicas deben usar cubetas con tapa para evitar derrames. Espectroscopía básica Las fotocélulas utilizadas en los fotómetros son similares a las utilizadas en los colorímetros. En muchos casos, se deben usar diferentes fotocélulas cuando las longitudes de onda están por encima o por debajo de 550 ~ 600 nm porque tienen diferentes características en las longitudes de onda visibles. Los detectores que son más sensibles y estables que las fotocélulas están reemplazando gradualmente a los punteros y algunos instrumentos pueden dar lecturas directas del valor medido.
Tipos de espectrofotómetros UV/visible:
Si la absorbancia de un determinado). Se conoce una sustancia a una determinada longitud de onda (generalmente el valor máximo de absorción de la sustancia, cuando la sensibilidad es más alta), puede usar el método de Bill-Lang. Calcule la concentración de una solución pura de la sustancia usando la relación de Bertrand.
El coeficiente de absorción molar se refiere al valor de absorbancia de la sustancia cuando la concentración es 65438±0mol/L y el espesor de la cubeta es 65438±0cm. Este valor se puede encontrar en la tabla de datos espectrales. También se pueden medir experimentalmente los valores de absorción de una serie de sustancias con concentraciones conocidas y dibujar una curva estándar. De esta manera, dentro del rango de concentración requerido, se puede determinar la relación lineal entre el valor de absorción y la concentración. La pendiente de esta línea recta es el coeficiente de absorción molar.
La absorbancia específica se refiere a la absorbancia medida cuando la concentración de la solución en masa es 65438±00g/L y el espesor de la cubeta es 65438±0cm. Este valor es útil para determinar sustancias de peso molecular desconocido, como proteínas y ácidos nucleicos. En este caso, la cantidad de una sustancia en una solución se expresa en términos de su masa en lugar de su concentración molar. Cuando se utiliza la fórmula Log10(Io/I)=εl[C],
Este método simple no se puede utilizar para determinar muestras mixtas. En este caso, el contenido de cada componente se puede estimar midiendo la absorbancia en varias longitudes de onda; por ejemplo, el contenido de proteínas se puede estimar en presencia de ácidos nucleicos mediante este método.
Cómo utilizar el espectrofotómetro:
(1) Encienda la alimentación; (2) Caliente durante 65438 ± 05 minutos antes de usarlo (3) Seleccione la longitud de onda; Seleccione el dispositivo de detección; (5) Si es posible, seleccione el ancho de ranura correcto; (6) Inserte un control en blanco apropiado; (7) Ajuste la transmitancia a 0; (8) Ajuste el valor de absorción a cero; (10) Después de medir 10 muestras, utilice un control en blanco para verificar la escala cero (11) Pruebe la repetibilidad del instrumento;