Investigación relacionada sobre la línea celular RAW 264.7 editada genéticamente que ayuda a la inflamación y la osteoclastogénesis
RAW264.7 es una línea celular similar a monocitos/macrófagos, que es una línea celular transformada derivada del virus de la leucemia de Abelson derivada del microARN BALB/c. RAW 264.7 es uno de los modelos in vitro más utilizados en la investigación de osteoclastos e inflamación.
1.? Investigación sobre la formación de osteoclastos:
Se ha demostrado que RAW 264.7 se diferencia fácilmente en osteoclastos bajo la inducción de RANKL. A diferencia de los precursores primarios de osteoclastos, la diferenciación de RAW 264.7 no requiere la adición de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).
2.? Investigación sobre la inflamación:
RAW264.7 es el modelo de investigación in vitro más utilizado para detectar sustancias activas antiinflamatorias y estudiar la inflamación. Bajo la acción de inductores (como el lipopolisacárido LPS), las células RAW264.7 pueden simular respuestas inflamatorias y liberar o regular positivamente una variedad de mediadores inflamatorios como el óxido nítrico (NO), la ciclooxigenasa-2 (COX-2), el factor de necrosis tumoral α. (TNF-α), interleucina 6 (IL-6), etc.
Se informa que la artritis reumatoide (AR) afecta a más de 265.438 millones de personas en todo el mundo. La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria autoinmune que afecta las articulaciones. Se caracteriza por infiltración de macrófagos y linfocitos, proliferación de fibroblastos sinoviales y eventual destrucción de la articulación. Los macrófagos juegan un papel importante en la patogénesis de la artritis reumatoide. El número de macrófagos en la membrana sinovial inflamatoria de la AR es mayor que el de las articulaciones normales y se correlaciona positivamente con la gravedad del dolor y la inflamación articular. Se han aprobado muchos medicamentos, terapias genéticas o celulares, para tratar la artritis reumatoide.
El microARN 155 (Mir-155) se encontró en el gen BIC en el cromosoma 16 de ratón y en el cromosoma 21 humano. En modelos clínicos y experimentales, miR-155 ha sido implicado en la patogénesis de la AR, ya que está regulado positivamente en los macrófagos sinoviales y del líquido sinovial de pacientes con AR. El ARNip que interfiere con miR-155 (KD) puede inhibir la producción de citoquinas proinflamatorias. MiR-155 puede estar involucrado en la formación de AR de múltiples maneras, una de las cuales es que MiR-155 se dirige a tres regiones no traducidas de la homología Src-2, incluida la inositol fosfolipasa 1 (SHIP1), que es un regulador negativo de la regulación de la inflamación. factores. Por lo tanto, la elevación de miR-155 en la AR conduce a una disminución de los niveles de SHIP1 y a un aumento de las citoquinas proinflamatorias.
Los investigadores utilizaron la tecnología CRISPR/CAS9 para mutar con éxito el gen endógeno miR-155 del macrófago de ratón RAW264.7 y obtuvieron un clon genómico knockout (GKO) de miR-155. Un análisis más detallado mostró que el clon miR-155 GKO expresaba niveles más altos de SHIP1 pero producía menos citocinas proinflamatorias tras la estimulación con LPS.
Al utilizar un clon de miR-155 GKO, la eliminación de miR-155 dio como resultado una producción reducida de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos, lo que confirma observaciones previas de que el aumento de miR-155 ayuda a los pacientes con AR. Niveles sostenidos de producción de citoquinas. . Al transfectar un imitador de miR-155 nuevamente en un clon de GKO, los investigadores pueden reintroducir el efecto miR-155. En conjunto, estos resultados sugieren que las mutaciones en el gen endógeno miR-155 pueden causar que el producto pre-miR-155 se trunque y no pueda madurar hasta convertirse en el miR-155 más corto pero estable.
La proteína de la familia NLR NLRP3 es un sensor citoplasmático de patógenos exógenos y patrones moleculares asociados al daño endógeno (DAMP). Después de la activación, NLRP3 se ensambla con la proteína adaptadora ASC y la cisteína proteasa caspasa-1 para formar el inflamasoma de NLRP3, lo que lleva a la escisión y activación de caspasa-1.
La capasa-1 activada escinde las citocinas IL-1 y el precursor de IL-18, madurándolas y provocando la liberación de varias citocinas proinflamatorias, incluidas las citocinas IL-1 e IL-183. Se ha informado que el inflamasoma NLRP3 juega un papel importante en la aparición y desarrollo de diversas enfermedades inflamatorias. Se ha demostrado que la inhibición de la señalización del inflamasoma NLRP3 es eficaz para aliviar el shock séptico, la peritonitis, la enfermedad de Alzheimer, la aterosclerosis, la diabetes tipo 2, la esclerosis múltiple, la gota y otras enfermedades. Por tanto, el inflamasoma NLRP3 es un objetivo excelente para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias.
El uso de CRISPR/Cas9 para destruir directamente la molécula clave NLRP3 a nivel del genoma no solo puede inhibir completamente la activación del inflamasoma nlrp 3, sino que también evita la posibilidad de inhibir vías no objetivo de anti- Agentes biológicos e inhibidores del riesgo inflamatorio. Se espera que el estudio de la estrategia CRISPR/Cas9 para eliminar NLRP3 se convierta en una forma más eficaz de tratar diversas enfermedades inflamatorias.
En este estudio, los investigadores informan sobre un sistema de entrega sistemático CRISPR/cas9? Encapsulando mCas9 y gNLRP3 en CLAN. CLAN es una nanopartícula basada en PEG-b-PLGA complementada con el lípido catiónico BHEM-Chol para la administración de terapias con ácidos nucleicos. En trabajos anteriores, los investigadores han introducido pequeños ARN de interferencia, aptámeros de ARN y CpG del virus de la hepatitis B en células tumorales, cardiomiocitos, macrófagos o familias de células dendríticas similares al plasma.
Pero mCas9/gNLRP3 es diferente de otras terapias con ácidos nucleicos. Las propiedades de las nanopartículas afectan la eficiencia de la administración del fármaco. Para probar si CLAN42 podría administrar eficientemente mCas9/gRNA, los investigadores encapsularon Cas9, mRNA de proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) (Cas9-EGFP mRNA o mCas9-EGFP) y gRNA de control negativo (gNC) en un clan específico ( CLANmCas9-EGFP/gNC). Se transfectaron macrófagos derivados de médula ósea con diferentes CLANmCas9-EGFP/gNC. La tasa positiva de EGFP de células estromales de la médula ósea en el grupo de transfección fue la más alta. A continuación, los investigadores examinaron la eliminación de genes transfectando células Raw264.7 (una línea celular de macrófagos) que expresan de manera estable GFP (Raw264.7-GFP) y CLAN que encapsula mCas9 y gRNA dirigido a GFP (eficiencia de CLAN mCas9/GGFP). El porcentaje de células Raw264.7-GFP desactivadas en el gen gfp en el grupo de transfección fue el más alto, alcanzando el 53,9%. Al inyectar a ratones diferentes CLANmCas9-EGFP/gNC, los investigadores confirmaron aún más la eficiencia de propagación de CLAN42 in vivo mCas9/gRNA. La tasa positiva de EGFP de macrófagos peritoneales en el grupo de inyección fue la más alta (48,4%). En resumen, CLAN42 es el más eficaz en la administración de mCas9/gRNA debido a su mayor capacidad de absorción por macrófagos. CLAN42 es más adecuado para encapsular mCas9/gNLRP3 (llamado CLAN mCas9/gNLRP3) para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias.
Por lo tanto, los investigadores establecieron una biblioteca grupal con diferentes cargas superficiales y densidades de PEG ajustando el peso del lípido catiónico BHEM-Chol y la fracción de masa de PEG5K-b-PLGA11K en el polímero. Los investigadores examinaron familias in vitro e in vivo, seleccionaron una mejor familia, introdujeron mCas9/gNLRP3 en macrófagos y mejoraron el shock séptico inducido por mCas9/gNLRP3, la peritonitis y la enfermedad inducida por HFD al destruir NLRP3 en macrófagos con diabetes tipo 2. Este estudio proporciona una estrategia prometedora para que CRISPR/Cas9 ingrese a los macrófagos y trate diversas enfermedades inflamatorias.
Los resultados indican que CLANmCas9/gNLRP3 es un enfoque prometedor para tratar enfermedades inflamatorias dependientes de NLRP3. El estudio también proporciona un paradigma para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario mediante la edición de genes de células inmunitarias mediada por nanopartículas.