¿Terapia génica?
Métodos de terapia génica
1. Métodos de transferencia génica
(1) Aislamiento y clonación de genes normales específicos: combinación de ADN recombinante y tecnología de clonación molecular con posicionamiento genético. Combinando los resultados de la investigación, se aislaron y clonaron muchos genes, lo que es un requisito previo para la terapia génica. En términos generales, cualquier gen se puede clonar siempre que existan sondas genéticas y un posicionamiento genético preciso. Además, ahora se pueden sintetizar artificialmente sondas y genes de ADN in vitro utilizando sintetizadores de ADN, lo que constituye una condición favorable para aislar y clonar genes específicos antes de la terapia génica.
(2) Transferencia de genes extraños: La transferencia de genes es la introducción de genes extraños en las células. Existen muchos métodos de transferencia, incluidos los siguientes:
1) Método químico: el ADN del gen normal (y su copia) se mezcla con sustancias cargadas y fosfato cálcico, DEAE-glucosa o ciertos lípidos para formar Las partículas de ADN precipitadas se vierten directamente en el medio de cultivo para que entren en contacto con las células. Debido a que los iones de calcio pueden promover la penetración del ADN en las células, algunos compuestos pueden alterar las membranas celulares, por lo que el ADN puede importarse a las células e integrarse en el genoma de las células receptoras, y los genes integrados pueden expresarse en condiciones apropiadas. Este método es simple, pero extremadamente ineficaz. Generalmente, sólo una célula de cada 1.000-100.000 células puede unirse al gen extraño introducido. Para lograr objetivos terapéuticos, es necesario obtener de los pacientes una gran cantidad de células receptoras. Por supuesto, la tasa de transformación se puede mejorar mediante el cultivo selectivo.
2) Métodos físicos: incluyendo electroporación y microinyección directa.
① Electroporación: La electroporación consiste en colocar las células en un campo eléctrico pulsado de alto voltaje y provocar la perforación reversible de las células mediante una descarga eléctrica. El ADN de la matriz circundante puede penetrar en las células, pero a veces puede causar daños graves a las células.
②Microinyección: La microinyección consiste en inyectar genes extraños directamente en el núcleo bajo el microscopio, lo que debería ser efectivo. Sin embargo, sólo se puede inyectar una célula a la vez, lo que requiere mucho trabajo y tiempo. Cuando este método se utiliza en células germinales, la eficacia puede alcanzar el 10%. Es difícil utilizarlo directamente en células somáticas. En experimentos con animales, este método se utiliza para inyectar el gen de interés en las células germinales para que pueda expresarse y transmitirse. Estos animales se denominan animales genéticamente modificados. En la actualidad, los ratones transgénicos se han utilizado ampliamente con éxito y pueden utilizarse como modelos animales de enfermedades para reproducir un gran número de crías.
③Método de liposomas: el método de liposomas consiste en envolver genes exógenos con liposomas artificiales y luego fusionarlos con células objetivo o inyectarlos directamente en el tejido de la lesión para su expresión.
3) Método de recombinación homóloga: La recombinación homóloga se refiere a la introducción de genes extraños en los cromosomas de las células receptoras. Dado que hay una secuencia homóloga en este sitio, el gen defectuoso se puede corregir reemplazando el fragmento defectuoso con un nuevo fragmento de gen mediante intercambio simple o doble. Si un gen Neo se ensambla junto a un nuevo fragmento de gen, después de la recombinación homóloga, puede crecer en un medio que contenga neomicina debido al gen Neo, lo que resulta en la muerte de las células sin el nuevo fragmento de gen insertado. Para la terapia génica de células somáticas, el tiempo para cultivar células in vitro no debe ser demasiado largo y la cantidad de pruebas de detección es grande, por lo que su aplicación clínica también es limitada y difícil. Si la tecnología puede mejorarse en el futuro para aumentar la tasa de recombinación, este método de modificación genética dirigida al sitio sigue siendo prometedor.
4) Transferencia de genes mediada por virus: todos los métodos químicos y físicos mencionados anteriormente realizan la transferencia de genes a través de infección. La transferencia de genes mediada por virus se completa mediante transformación, es decir, utilizando virus como vectores, el gen objetivo extraño se ensambla en el virus mediante tecnología de recombinación genética y se permite que el virus recombinante infecte la célula huésped receptora. Este virus se llama virus portador. Actualmente, existen dos métodos de transferencia de genes mediados por virus.
① Vector de retrovirus: El retrovirus es un virus de ARN, pero tiene una enzima transcriptasa inversa que puede transcribir el ARN en ADN y luego integrarlo en el genoma de la célula huésped.
Los vectores retrovirales tienen las siguientes ventajas: en primer lugar, tienen la capacidad de penetrar en las células, pueden infectar casi el 100% de las células receptoras y tienen una alta eficiencia en la transformación de células; en segundo lugar, pueden infectar una amplia gama de especies animales y tipos de células; y no existen requisitos estrictos de especificidad del tejido; además, los virus integrados aleatoriamente pueden sobrevivir durante mucho tiempo y generalmente son inofensivos para las células, pero también tienen algunas desventajas: este vector sólo puede integrar su ADN en los cromosomas que permiten el crecimiento vigoroso de la división; células, pero no es adecuado para células que no pueden dividirse normalmente, como las neuronas. El problema más grave es que, debido a que el virus en sí contiene proteínas y oncogenes virales, es peligroso que infecte las células huésped y cause cáncer. Por lo tanto, las personas eliminan intencionadamente los genes virales y sus oncogenes, dejando sólo las proteínas de su cubierta para conservar su función de penetración celular en un intento de evitar las deficiencias anteriores. Este virus modificado se llama virus defectuoso. La transcriptasa inversa del virus convierte el ARN en ADN, lo que ayuda a que el ADN entre sin problemas en el genoma de la célula huésped y el virus muere. Debido a que el genoma integrado del virus es aleatorio, todavía es posible activar el protooncogén de la célula e insertar mutaciones debido a la inserción aleatoria. Entre los vectores retrovirales, el virus de la leucemia murina de Moloney es la construcción artificial más utilizada en humanos.
②Vectores mediados por virus de ADN: los virus de ADN incluyen adenovirus, SV40, virus del papiloma bovino, virus del herpes, etc. En general, se cree que estos virus son difíciles de transformar en virus defectuosos. Después de la recombinación, el virus del papiloma bovino no puede insertarse en el cromosoma del huésped para causar mutaciones de inserción, pero puede replicarse y expresar de forma independiente productos genéticos fuera del cromosoma del huésped. Se ha descubierto que los adenovirus que tienen una replicación deficiente debido a la falta de la región E1 pueden propagarse en células que expresan el gen E1. Más tarde se demostró que los adenovirus con replicación deficiente que portan ADN extraño también exhibían las mismas propiedades reproductivas. Durante 1993, Estados Unidos, Francia y otros países utilizaron con éxito vectores de adenovirus para llevar a cabo la transferencia de genes en el corazón, el cerebro, los pulmones, los conductos biliares intrahepáticos y el tejido muscular. Representa una nueva dirección en la terapia génica. Estados Unidos ha diseñado un nuevo vector de adenosis que utiliza conectores químicos, concretamente cadenas de lisina, para unir el ADN a la cubierta del virus, permitiendo que el transportador entre en el núcleo celular a través de anticuerpos de superficie, lo que permite coexpresar los genes del huésped y los genes terapéuticos. El nuevo vector viral se llama complejo de ADN de polilisina de adenovirus. La terapia génica con adenovirus de replicación deficiente tiene las siguientes ventajas:
① El virus puede infectar células en división y no en división y obtener una gran cantidad de productos genéticos, lo que es de especial importancia para corregir defectos genéticos en las células nerviosas. cardiomiocitos, etc.;
②Las partículas de virus son relativamente estables, fáciles de purificar y concentrar, y la infectividad no se reduce;
③Puede transducir eficazmente una variedad de células diana, pero es menos libre en el genoma celular y persiste Expresión;
④ El subgrupo C del adenovirus Ad5 que se ha utilizado para terapia génica no tiene carcinogenicidad. Otra ventaja del nuevo vector adenoviral mencionado anteriormente es que puede transportar con éxito un gen de 48.000 pb, mientras que otros virus sólo pueden transportar genes de 70.000 pb. Estas ventajas muestran las amplias perspectivas de aplicación de los vectores de adenovirus.
2. Principios para seleccionar las células diana
Las células diana mencionadas aquí se refieren a las células somáticas que reciben el gen transferido.
Los principios para seleccionar las células diana son:
(1) Deben ser lo suficientemente fuertes para resistir el tratamiento, y deben ser fáciles de separar del cuerpo humano y fáciles de reinfundir en el cuerpo;
② Tiene las ventajas de la proliferación y un ciclo de vida largo, puede sobrevivir de meses a años y, en última instancia, dura toda la vida del paciente.
③Fácil de transformar mediante genética exógena; material;
④Transcripción inversa seleccionada Cuando se utilizan vectores virales, es mejor expresar el gen de interés en células específicas de tejido. Actualmente se utilizan ampliamente las células madre de la médula ósea, los fibroblastos de la piel, las células del hígado, las células endoteliales vasculares, las células musculares, etc. Muchas enfermedades genéticas, como la beta talasemia y los trastornos de inmunodeficiencia combinada graves, involucran células hematopoyéticas y, por lo tanto, podrían usarse para terapia génica. Los fibroblastos de la piel son fáciles de trasplantar y aislar del cuerpo, crecen en cultivo y sobreviven fácilmente, por lo que algunas personas los usan para la terapia genética de la hemofilia b. Muchas enfermedades genéticas se manifiestan como disfunción de las células hepáticas. Por lo tanto, en el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar, se ha intentado transferir el gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL) a los hepatocitos. Los experimentos con animales han demostrado que el gen de la β-galactosidasa, el gen ADA y el gen de la minidistrofina pueden expresarse en células musculares.
Procedimiento básico de edición de este apartado.
Terapia génica
(1) Obtención de genes terapéuticos (2) Selección de vectores genéticos (3) Selección de células diana (4) Métodos de transferencia génica (5) Células transducidas Selección y identificación (6) Transfusión de sangre en el cuerpo.
Pasos básicos para editar este párrafo
Transferencia de genes diana
Terapia génica
Transferencia de genes diana utilizados en terapia génica hasta el momento Los métodos se pueden dividir en dos categorías: métodos virales y métodos no virales. En los métodos virales de transferencia de genes, se pueden utilizar virus tanto de ARN como de ADN como vectores para la transferencia de genes. Se utilizan comúnmente vectores retrovirales y vectores adenovirales. El proceso básico de transferencia consiste en recombinar el gen diana en el genoma viral y luego infectar las células huésped con el virus recombinante para integrar el gen diana en el genoma huésped. Los métodos no virales incluyen precipitación con fosfato cálcico, transfección con lipofectamina y microinyección.