¿Se pueden agregar anticuerpos dobles al detectar purinas en las células?
No es necesario añadirlo, a veces añadirlo tendrá un efecto antagónico.
1) Coloque la placa de 24 pocillos a una densidad de 5~8 x 104 células/pocillo y cubra un número suficiente de pocillos para experimentos de gradiente posteriores. Las células se incubaron durante la noche;
(2) Preparar medio de detección: medio fresco que contiene puromicina en diferentes concentraciones (como 0-15 μg/ml, al menos 5 gradientes; (3) Después de que las células se incubaron durante la noche; Agregue medio de detección e incube las células; (4) Reemplace con medio de detección nuevo en aproximadamente 2-3 días.
(5) Monitoree las células diariamente para observar la proporción de células supervivientes. El tiempo óptimo de acción de la puromicina es generalmente entre 1 y 4 días.
(6) La concentración mínima de antibiótico se refiere a la concentración de detección más baja que mata las células utilizadas dentro de 1 a 4 días desde el inicio de la detección de antibióticos.
Seleccionar células transfectadas estables con puromicina
(1) Día 0: Placa en una placa de 24 pocillos a una densidad de 5~8 x 104 células/pocillo e incubar durante la noche; /p>
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(2) Preparar medio de detección: medio fresco que contenga la concentración de detección óptima de puromicina (determinada por la curva de destrucción
(3) día 1: el primero); el día de la selección, retire el medio de cultivo antiguo y agregue una cierta cantidad de partículas de virus en MOI (la cantidad total de medio sin suero agregado debe cubrir completamente las células).
(4) Aproximadamente 6 -8 horas después de la transducción viral, agregar otro ml de medio de cultivo completo (suero y anticuerpos dobles, si se han utilizado anticuerpos dobles) a las células y luego incubar durante la noche
(5) 48 horas después; Transducción viral, use puromicina para seleccionar el medio de cultivo. Reemplace el medio completo anterior. Incubar. (6) Reemplace el medio de detección recién preparado aproximadamente cada 2-3 días.
(7) Detecte las células todos los días y observe la proporción de crecimiento de las células viables, así como el nivel y la proporción de expresión de turboGFP. En un momento determinado, casi todas las células viables expresan TurboGFP. La duración óptima de acción de la puromicina es de 3 a 10 días.
Nota: Cuanto mayor es el MOI del virus, más copias de shRNA y genes de resistencia a la puromicina contiene cada célula. Al realizar la detección de puromicina, recuerde que cuanto mayor sea el MOI, más copias pac las células pueden tolerar concentraciones más altas de puromicina. Ajuste la concentración de puromicina para seleccionar una cantidad predeterminada de células transducidas, pero la cantidad de puromicina no puede ser inferior a la concentración más baja establecida por la curva de destrucción.