Fórmula química del profármaco de platino tetravalente
Monómero de diaminoortoéster y n,n-dimetilformamida anhidra La proporción de alimentación de agua n,n-dimetilformamida es 1:2 ~ 5;
La proporción molar de monómero complejo de platino tetravalente y monómero de diaminoortoéster es 1:1.
Además, el monómero del complejo de platino tetravalente es cisplatino con grupos carboxilo en ambos extremos y la fórmula química es Pt(NH3)2cl2 (OOCCH2CO2h)2. La estructura del monómero del complejo de platino tetravalente es la siguiente Fórmula (ii) muestra:
El monómero diaminoortoéster es 4,4'-dimetoxi-bis-(2-aminoetoxi-1,3-dioxolano)).
Además, el activador carboxílico se selecciona entre N-hidroxisuccinimida, EDC y NHS.
Además, el proceso de reacción del paso (1) consiste en reaccionar a temperatura ambiente, secar, proteger de la luz y agitar durante 4-6 horas.
Además, el proceso de reacción del paso (2) consiste en evitar la luz y agitar durante 2-4 días en un ambiente de nitrógeno.
La presente invención también proporciona una micela de profármaco de polímero de ortoéster y complejo de platino tetravalente, el profármaco de polímero de ortoéster y complejo de platino tetravalente preparado mediante el método de preparación anterior o se prepara a partir de un profármaco de polímero de ortoéster y complejo de platino tetravalente.
La presente invención también proporciona un método para preparar micelas de profármaco de polímero de ortoéster y complejo de platino tetravalente, que se caracteriza porque el profármaco de polímero de ortoéster y complejo de platino tetravalente se disuelve completamente con dimetilsulfóxido. Se obtuvieron micelas.
La presente invención también proporciona la aplicación de un profármaco de polímero ortoéster-complejo de platino tetravalente como vehículo de fármaco en la preparación de fármacos antitumorales.
Además, esta aplicación se logra mediante los siguientes pasos: mezclar el profármaco de polímero ortoéster complejo de platino tetravalente y el vehículo del fármaco según una proporción de masa de 8-12:1, y colocarlo en dimetilo en sulfóxido. , se disuelve completamente y luego se dializa en una bolsa de diálisis para obtener una micela cargada de fármaco con complejo de platino tetravalente y polímero ortoéster;
Los vehículos del fármaco son camptotecina, paclitaxel, doxorrubicina y 5-fluorouracilo.
La ventaja de la presente invención es: de hecho, en comparación con las células normales, el entorno de las células tumorales tiene las características de una mayor concentración de glutatión reducido y un valor de pH más bajo. En base a esto, la presente invención proporciona un profármaco de polímero ortoéster de complejo de platino tetravalente, que contiene una alta concentración de platino tetravalente y puede existir de manera estable en la sangre durante mucho tiempo. Al mismo tiempo, a base de platino tetravalente reducible, se introduce un ácido de enlace ortoéster altamente sensible, que puede reaccionar, romper y provocar la liberación de fármacos antitumorales en el entorno especial de reducción y pH de las células tumorales. Por lo tanto, el profármaco proporcionado por la presente invención tiene las características de respuesta dual al pH y a las condiciones reductoras en las células tumorales, mejora la selectividad del fármaco, tiene funciones tales como sensibilización dirigida y sinérgica, y puede reducir los efectos secundarios tóxicos y la resistencia al fármaco. de la droga.
Además, los complejos de platino tetravalentes son octaédricos en comparación con los fármacos anticancerígenos de platino divalentes, tienen una reactividad más baja y una cinética de sustitución inerte y no son fáciles de interactuar con el glutatión intracelular, las proteínas, etc. permitiendo el acceso total a las células cancerosas. Debido a que el complejo de platino tetravalente es altamente lipófilo, las células cancerosas lo absorben fácilmente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es el espectro de RMN del profármaco polimérico en el Ejemplo 1 de la presente invención.
La Figura 2 es la realización de; la presente invención Diagrama de distribución del tamaño de partícula de la micela del profármaco ocm en el Ejemplo 2;
La Figura 3 es una imagen de microscopio electrónico de transmisión de la micela del profármaco ocm en el Ejemplo 2 de la presente invención;
La Figura 4 es la curva micelar crítica de la micela del profármaco ocm en el Ejemplo 3 de la presente invención;
La Figura 5 es el punto de la micela del profármaco ocm y la micela cargada con fármaco ocm/d en el Ejemplo 5 de la presente invención La curva de liberación de dox en diferentes condiciones de ph;
La Figura 6 es el pt de micelas cargadas con fármaco ocm/d en diferentes condiciones de ph y en presencia de dtt en el Ejemplo 6 de la presente invención y la curva de liberación de dox;
La Figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de la prueba de toxicidad de la micela del profármaco ocm en células hepg2 en el Ejemplo 7 de la presente invención;
Figura 8. es un gráfico de la presente invención de los resultados de la prueba de toxicidad de micelas cargadas con fármaco ocm/d en células hepg2 en el Ejemplo 7;
La Figura 9 es un diagrama que muestra los resultados de la prueba de toxicidad de micelas de profármaco ocm/d en células h22 en el Ejemplo 8 de la presente invención.
La Figura 10 muestra los resultados de la prueba de toxicidad de micelas cargadas con fármaco ocm/d en células h22 en el Ejemplo 8 de la presente invención;
La Figura 11 muestra las micelas cargadas con fármaco en el Ejemplo 9 de la presente invención. Resultados de detección cualitativa de la absorción micelar de ocm/d por células hepg2 y h22;
La Figura 12 es el resultado de la detección cuantitativa de micelas cargadas con fármaco. absorción de micelas de ocm/d por células hepg2 y h22 en el Ejemplo 9 de la presente invención.
Descripción detallada
Ejemplo 1: Preparación de profármaco de polímero ortoéster complejo de platino tetravalente
(1) Añadir 0,350 g (0,65 mmol) de cisplatino terminado en carboxilo con un peso molecular de 534,05, 0,314 g (1,64 mmol) de n-hidroxisuccinimida con un peso molecular de 1,7-(3,1,69 g (1,64 mmol)
( 2) Añadir 0,202 g (1,64 mmol) 4, 4'-dimetoxi-di-(2-aminoetoxi-1,3-dioxolano) con un peso molecular de 308,328 de antemano y disolverlo en 0,5 ml de n anhidro, en n-dimetilformamida, protegido de la luz bajo nitrógeno, y luego transferir el producto de reacción a una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 1000d, se dializó con agua durante 12 horas y se liofilizó para obtener 0,468 g de polimerización de ortoéster complejo de platino tetravalente, rendimiento 84,78 % 1 hnmr (. 400 mhz, dmso-d6, δ, ppm): 2,82-2,89 (t, 4h, h2-nh2), 3,51-3,74 (m, 8h, nh -ch2-ch2, ch2-o-ch2), 3,77-4,19. (m, 4h, ch-o-ch2), 4,29-4,50 (m, 2h, ch2-ch2), la posición y la relación de integración del área de todos los picos magnéticos nucleares son correctas, lo que indica que el polímero se sintetizó correctamente. >
Ejemplo 2: Preparación de micelas de profármaco
Disolver 20 mg del profármaco preparado en el Ejemplo 1 en 2 ml de dimetilsulfóxido y luego transferirlo a una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de. 500d durante 2 horas para obtener micelas de profármaco ocm.
La distribución del tamaño de partículas de las micelas preparadas en el Ejemplo 2 se detectó mediante espectroscopía de correlación de fotones (dls), los resultados se muestran en la Figura 2. Como se ve en la Figura 2, el tamaño de partícula de las micelas preparadas es de aproximadamente 100-200 nm. La morfología de las micelas preparadas en el Ejemplo 2 se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión, los resultados se muestran en la Figura 3. Se puede ver en la Figura 3 que las partículas de micelas preparadas son esféricas con tamaño y regularidad uniformes.
Ejemplo 3: Determinación de la concentración de micelas críticas de profármaco.
La concentración de micelas críticas de. la micela profármaco ocm preparada en el Ejemplo 2 se midió mediante el método de detección de Rojo Nilo, y su curva micelar crítica se muestra en la Figura 4. Se encuentra que la concentración micelar crítica de la micela ocm preparada en el Ejemplo 2 es 1,12 x 10-5 mg. /ml.
El proceso de detección específico del método de detección de Nile Red es el siguiente:
(1) Añadir 20 μl de Nile Red con una concentración de 1,0×10-4mol/l a 8 botellas marrones. Solución de acetona;
(2) Después de liofilizar la micela de profármaco polimérico ocm preparada en el Ejemplo 2, use una solución tampón de fosfato con pH = 7,4 y las concentraciones son 1 × 10-8. 1×10-7, 1×10-6, 1×10.
(3) Después de que la acetona en la botella marrón se haya evaporado por completo, agregue 2 ml de solución de gradiente e incube en la oscuridad durante 12 horas a temperatura ambiente; Utilice un espectrofotómetro de fluorescencia. Mida el espectro de emisión de Rojo Nilo en cada solución;
(5) Encuentre la longitud de onda correspondiente a la intensidad máxima de fluorescencia en el espectro de emisión de cada concentración y dibuje una curva de concentración-longitud de onda. Entonces, el punto de mutación de la curva corresponde a La concentración es el valor crítico de concentración micelar de OCM.
Preparación de micelas cargadas de fármaco en el Ejemplo 4
Disolver 80 mg del profármaco preparado en el Ejemplo 1 y 8 mg de doxorrubicina en 5 ml de dimetilsulfóxido, y luego transferir a Dialyze durante 2 horas en una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 500d para obtener micelas OCM/D cargadas con fármaco
Ejemplo 5: se extrae pt de las micelas del profármaco ocm y se extrae dox de las micelas ocm cargadas con fármaco / bajo diferentes condiciones de pH detección d liberación.
Tomar 1 ml de la micela ocm del profármaco con una concentración de Pt de 500 μg/ml y 1 ml de la micela ocm cargada con el fármaco con una concentración de doxorrubicina de 500 μg/ml, respectivamente, y transferirlos a dos moléculas Se colocaron pesos de bolsas de diálisis de 8 kd-14 kd en tubos EP que contenían 5 ml de tampón con valores de pH de 5, 6,5 y 7,4. Agite a 100 rpm durante 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36. Luego, se detectó la cantidad liberada de platino mediante ICP-MS, la concentración de doxorrubicina en el tampón se detectó mediante ELISA y se calculó la cantidad liberada de doxorrubicina. Los resultados de la publicación se muestran en la Figura 5. Como puede verse en la Figura 5, OCM y OCM/D son relativamente estables en un ambiente neutro, básicamente sin liberación de fármaco, cuanto menor es el valor de pH, más fármacos se liberan; Esto muestra que tanto las micelas de profármaco como las micelas cargadas de fármaco son sensibles a los ácidos.
Ejemplo 6: Liberación de pt y dox a partir de micelas de fármaco ocm/d en presencia de dtt en diferentes condiciones de ph
Tomar 1 ml de doxorrubicina con una concentración de 500 μg/ml micelas cargadas con fármaco ocm/d, colocadas en una bolsa de diálisis con un peso molecular de 8 kd-14 kd, colocadas en un tubo ep que contiene 5 ml de tampón de 20 mmddt con pH = 5, 6,5, 7,4, con tres réplicas, 37 °C, 100 rpm . Después de 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 24 horas después, retire el tampón y agregue un nuevo tampón. La cantidad liberada de platino se detectó mediante ICP-MS, la concentración de doxorrubicina en el tampón se detectó mediante ELISA y luego se calculó la cantidad liberada de doxorrubicina. Los resultados de la publicación se muestran en la Figura 6. Como puede verse en la Figura 6, en presencia de ddt, las velocidades de liberación del fármaco de ocm y ocm/d son más rápidas que aquellas sin ddt, lo que indica que las micelas son sensibles a la reducción.
Ejemplo 7: Prueba de toxicidad de micelas de profármaco ocm y micelas cargadas de fármaco ocm/d en células hepg2
(1) Agregue células de cáncer de hígado humano (hepg2) a una placa de 96 pocillos. asegurando que la concentración de células por pocillo sea de aproximadamente 4.000. Después del cultivo en monocapa durante 24 horas, retire el medio y agregue 180 µl de medio fresco.
(2) Tome la placa de 96 pocillos en el paso (1) y agregue 20 µl de solución acuosa de cisplatino (cp); a cada pocillo Las concentraciones finales de cisplatino en cada pocillo fueron 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 μg/ml, respectivamente, para obtener el grupo experimental 1.
Tome la placa de 96 pocillos del paso (1), agregue 20 μl de micela de profármaco ocm a cada pocillo, de modo que la concentración final de cisplatino en cada pocillo sea 0,5, 1, 2, 4, 8, y 16 μg/ml respectivamente, obtenga el grupo experimental 2;
Tome la placa de 96 pocillos en el paso (1), agregue 20 μl de solución acuosa mixta de cisplatino y doxorrubicina (CP+DOX) a cada pocillo. , de modo que la concentración final de cisplatino en cada pocillo sea respectivamente Los valores son 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 μg/ml, y se obtiene el grupo experimental 3;
Tomar la Placa de 96 pocillos en el paso (1) y agregue 20 l de micelas cargadas con fármaco ocm/d a cada pocillo. Haga que la concentración final de cisplatino en cada pocillo sea de 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 μg/ml respectivamente. para obtener el grupo experimental 4;
(3) Los grupos experimentales 1-4 se cultivaron durante 24 h y 48 h respectivamente y se eliminó el medio de cultivo, luego se agregaron 180 μl de medio de cultivo fresco y 20 μl de lmtt (5 mg/ml)* *; * durante 4 horas, luego retire el medio de cultivo, luego agregue 150 μl de DMSO, agite bien durante 10 minutos y detecte a una longitud de onda de 570 nm. Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8, donde la Figura 7 muestra la citotoxicidad de cp y ocm, y la Figura 8 muestra la citotoxicidad de cp+dox y OCM/D.
De la Figura 7 y la Figura 8 Se puede observar que ocm y ocm/d muestran toxicidad dependiente de la dosis y el tiempo. La toxicidad del grupo ocm es mayor que la del grupo cp, y el grupo ocm/d es mayor que la del grupo cp+dox. /d tiene la citotoxicidad más fuerte.
Ejemplo 8: Prueba de toxicidad de micelas de profármaco ocm y micelas cargadas de fármaco ocm/d en células h22
(1) Agregue células de cáncer de hígado de ratón (h22) a una placa de 96 pocillos. asegúrese de que la concentración celular en cada pocillo sea de aproximadamente 4000 y agregue medio de cultivo nuevo a 180 µl.
(2) Tome la placa de 96 pocillos en el paso (1) y agregue 20 µl de cisplatino acuoso; solución (cp ), de modo que las concentraciones finales de cisplatino en cada pocillo fueron 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 μg/ml, respectivamente, para obtener el grupo experimental 1.
Tome la placa de 96 pocillos del paso (1), agregue 20 μl de micela de profármaco ocm a cada pocillo, de modo que la concentración final de cisplatino en cada pocillo sea 0,5, 1, 2, 4, 8, y 16 μg/ml respectivamente, obtenga el grupo experimental 2;
Tome la placa de 96 pocillos en el paso (1), agregue 20 μl de solución acuosa mixta de cisplatino y doxorrubicina (CP+DOX) a cada pocillo. , de modo que la concentración final de cisplatino en cada pocillo sea respectivamente Los valores son 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 μg/ml, y se obtiene el grupo experimental 3;
Tomar la Placa de 96 pocillos en el paso (1) y agregue 20 l de micelas cargadas con fármaco ocm/d a cada pocillo. Haga que la concentración final de cisplatino en cada pocillo sea de 0,5, 1, 2, 4, 8 y 16 μg/ml respectivamente. para obtener el grupo experimental 4;
(3) Los grupos experimentales 1-4 se cultivaron durante 24 h y 48 h respectivamente, y luego se agregaron 20 μ lmtt (5 mg/ml) y se cultivaron durante 4 h. Luego agregue 65438 ± 050 μl de solución de trimetoprima, agite bien durante 65438 ± 00 min y detecte a una longitud de onda de 490 nm. Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10. La Figura 9 muestra la citotoxicidad de los grupos cp y ocm, y la Figura 10 muestra la citotoxicidad de los grupos cp+dox y ocm/d.
Como se puede ver en las Figuras 9 y 10, los resultados de las pruebas de toxicidad de OCM y OCM/D en células H22 son similares a los de células HepG2.
Ejemplo Detección cualitativa de micelas cargadas de fármaco ocm/d en células hepg2 y h22.
Agrupe un experimento:
(1) Agregue células de cáncer de hígado humano (hepg2) a una placa de 12 pocillos con un cubreobjetos en la parte inferior para garantizar que la concentración celular en cada pocillo es aproximadamente 105. Después de cultivar durante la noche, retire el medio de cultivo y agregue 1,8 ml de medio de cultivo fresco.
(2) Tome la placa de 12 pocillos del paso (1), agregue 0 doxorrubicina a cada pocillo; , y la concentración final es 8 μg/ml, obtenga el grupo experimental 1;
Tome la placa de 12 pocillos en el paso (1), agregue 0,2 ml de doxorrubicina con una concentración final de 8 μg/ml de micelas cargadas con fármaco polimérico ocm/d a cada pocillo, se obtiene el grupo experimental 2;
(3) Los grupos experimentales 1-2 se cultivaron durante 0,5 h y 4 h respectivamente, y luego se eliminó el medio. Las células primero se lavaron dos veces con PBS, luego se fijaron con solución de paraformaldehído al 4%, se lavaron dos veces con PBS después de 5 minutos, luego se tiñeron con reactivo de tinción nuclear, se lavaron dos veces con PBS después de 10 minutos, se centrifugaron para recolectar las células y luego se dispersaron con 0,5 ml de PBS, mediante láser.
Experimento del grupo B: utilice el experimento del grupo A, excepto que las células agregadas en el paso (1) son células de cáncer de hígado de ratón (h22).
Los resultados experimentales del Grupo A y del Grupo B se muestran en la Figura 11. Como se puede ver en la Figura 11, tanto el grupo ocm/d como el grupo freedox tienen diversos grados de señales de fluorescencia rojas, lo que indica que las células pueden absorber con éxito las micelas cargadas de fármaco. No hubo diferencias significativas a las 0,5 h. Después de que el tiempo de incubación se incrementó a 4 h, la intensidad de fluorescencia del grupo ocm/d fue significativamente mayor que la del grupo freedox.
Ejemplo 10: Detección cuantitativa de la captación de células hepg2 y h22 por micelas cargadas de fármaco ocm/d
Agrupar un experimento:
(1) Cáncer de hígado humano Se agregaron células (hepg2) a la placa de 6 pocillos para garantizar que la concentración celular por pocillo fuera de aproximadamente 2,5 x 105 células. Después del cultivo durante la noche, se eliminó el medio y se añadieron 1,8 ml de medio nuevo.
(2) Tome la placa de 6 pocillos del paso (1) y agregue doxorrubicina libre a cada pocillo hasta que la concentración final de doxorrubicina sea de 8 μg/ml;
Tome los 6 -placa de pocillos en el paso (1) y agregue micelas cargadas con fármaco ocm/d a cada pocillo hasta que la concentración final de doxorrubicina sea 8 μg/ml;
(3) Grupos experimentales 1-2 respectivamente Después del cultivo durante 0,5 hy 4 h, se eliminó el medio de cultivo, se lavó dos veces con PBS, se digirió con tripsina y luego se centrifugó para recolectar las células, se dispersó con 0,5 ml de PBS y se detectó mediante citometría de flujo.
Experimento del grupo B: utilice el experimento del grupo A, excepto que las células agregadas en el paso (1) son células de cáncer de hígado de ratón (h22).
Los resultados experimentales del Grupo A y del Grupo B se muestran en la Figura 12. Como puede verse en la Figura 12, los resultados de la comparación de la absorción del grupo ocm/d y el grupo freedox son consistentes con los resultados de la comparación de la intensidad de fluorescencia en el experimento cualitativo, es decir, no hay una diferencia significativa a las 0,5 h. , y la absorción del grupo ocm/d es mayor que la del grupo freedox a las 4h.