Preparación de medios de cultivo sólidos
1. Pesaje
Utilizar una balanza electrónica con una precisión de 1/100 para pesar los fármacos necesarios para el medio de cultivo. Primero, calcule la cantidad de cada componente del fármaco necesaria para preparar una cierta cantidad de medio de cultivo según la fórmula y luego péselo con precisión con una balanza. Al pesar, doble el papel de pesar en forma de recogedor para contener el medicamento. Cómo doblar papel para pesar.
Derretir
Colocar el medio de cultivo en un vaso de precipitados o tarro de porcelana, añadir poco a poco una pequeña cantidad de agua y remover con una varilla de cristal mientras se añade. Si el medio no contiene agar, no es necesario calentarlo; si contiene agar, es necesario calentarlo y hervirlo con un mechero Bunsen o una cocina de inducción. Después de la disolución completa, se debe agregar el agua requerida y agitar uniformemente. Si preparas una gran cantidad de medio de cultivo, puedes utilizar una olla de acero inoxidable para calentarlo y derretirlo. Primero, se puede calentar con agua tibia y remover en cualquier momento para evitar que se coque. Si hay coque, el medio preparado no se puede utilizar y es necesario prepararlo nuevamente.
Al preparar el medio de cultivo, no se permite fundirlo en un recipiente de cobre o hierro, porque el recipiente de cobre o hierro puede hacer que el contenido de cobre y hierro en el medio de cultivo supere el estándar y afecte. el experimento (el contenido de cobre en el medio de cultivo es superior a 0,3 mg/L, no apto para el crecimiento bacteriano, el contenido de hierro es superior a 0,14 mg/L, lo que evitará que las bacterias produzcan toxinas). Los medicamentos que son propensos a reaccionar y precipitar deben disolverse por separado y finalmente agregarse al medio de cultivo, como dihidrógenofosfato de potasio, sulfato de magnesio, etc.
3. Ajustar el valor de pH
Aunque el medio de cultivo contiene sustancias tampón que pueden mantener el valor de pH del medio de cultivo dentro del rango requerido tanto como sea posible, si el cultivo preparado El medio no Para cumplir con los requisitos, se deben realizar los ajustes necesarios. Puedes utilizar un acidómetro si tienes uno calibrado.
De lo contrario, utilice papel de prueba de pH de precisión y luego ajuste el valor de pH requerido con 1 mol/L de hidróxido de sodio o 1 mol/L de ácido clorhídrico según sea necesario (puede usar 0,1 mol/L de hidróxido de sodio o 0,1 mol /L de ácido clorhídrico para ajuste fino).
El valor de pH del medio de cultivo es generalmente de 7,4~7,6, que también puede ser ácido o alcalino. Cuando se utiliza hidróxido de sodio para ajustar el valor de pH de un medio de cultivo que requiere esterilización en autoclave, se debe ajustar entre 0,1 y 0,2 unidades más de lo requerido, porque el valor de pH del medio de cultivo disminuirá entre 0,1 y 0,2 después de la esterilización en autoclave. Si el medio de cultivo contiene carbonato de calcio, se puede ajustar el pH.
Paso 4: Filtración
Si no hay requisitos especiales para el medio de cultivo preparado, este paso se puede omitir. Si hay precipitado o turbidez que necesita ser clarificado, filtrar el medio de cultivo líquido con papel de filtro. Los medios sólidos se pueden filtrar a través de una doble capa de gasa con una fina capa de algodón absorbente en el medio.
Si el método de filtración no puede cumplir con los requisitos de clarificación, se puede utilizar el método de clarificación de clara de huevo, es decir, el medio de cultivo se calienta y se enfría a 50 ℃ ~ 60 ℃, se coloca en un matraz Erlenmeyer (no excediendo la mitad de la capacidad), y agregue 1000 ml de 1 ~ 2 claras de huevo, agite vigorosamente durante 3 min ~ 5 min, esterilización con vapor a alta presión 1265438+.
5. Embalaje
Empaque el medio de cultivo preparado en matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo y otros recipientes según los diferentes usos, y los tubos de ensayo se empaquetan por separado. Si los tubos de ensayo son grandes, se puede utilizar un separador de líquidos automático.
Si el número de tubos de ensayo es pequeño, se pueden envasar en embudos. Las cantidades de reenvasado no deben exceder los dos tercios del volumen del contenedor. El matraz Erlenmeyer no debe exceder la mitad del volumen; la pendiente de agar no debe exceder una quinta parte de la longitud del tubo de ensayo. Después de la esterilización, la pendiente debe ser un tercio del medio de cultivo y dos tercios de la capa inferior. La cantidad de agar semisólido es un tercio de la longitud del tubo de ensayo.
Para el agar de alta calidad utilizado para la inoculación o conservación de cepas, el volumen de la alícuota debe ser de un cuarto o un tercio de la longitud del tubo de ensayo, y el volumen utilizado para la inoculación de bacterias anaeróbicas debe alcanzar dos tercios de la placa de agar, el diámetro interior de 90 mm es de 13 ml a 15 ml, el diámetro interior de 70 mm es de 8 ml a 10 ml.
Si hay mucha humedad en la superficie, se puede voltear la placa, colocarla en una incubadora a 37°C durante 30 minutos y dejar secar antes de usar. Se envasa por separado una pequeña botella de vidrio (aproximadamente 20 ml) en cada lote de medio de cultivo y se esteriliza al mismo tiempo que el lote de medio de cultivo para determinar el valor de pH final del lote de medio de cultivo.
6. Esterilización
El medio de cultivo debe esterilizarse inmediatamente después del envasado.
7. Invierta la placa
Después de que el medio de cultivo esterilizado y disuelto se haya enfriado a unos 50 °C, viértalo en una placa de Petri seca y esterilizada. La temperatura del medio de cultivo no puede ser demasiado alta; de lo contrario, se formará fácilmente demasiada agua de condensación en la tapa de la placa de Petri. Si la temperatura es demasiado baja, el medio de cultivo se solidificará fácilmente en bloques y no podrá convertirse en una placa plana; .
A la hora de verter el plato, se debe hacer cerca de la llama de la lámpara de alcohol para evitar que entren materias extrañas y bacterias en el plato. Sostenga la placa de Petri con la mano izquierda y el fondo del matraz Erlenmeyer con la mano derecha. Utilice el dedo meñique y la palma de la mano izquierda para quitar el tapón de algodón del matraz Erlenmeyer. Abra la tapa. de la placa de Petri con el pulgar y el índice hasta que la boca de la botella llegue apenas hacia adentro. Vierta Agregue medio de cultivo para cubrir el fondo, no más de un tercio de la altura de la placa de Petri, cúbralo rápidamente y colóquelo. sobre la mesa.
8. Balancee el plano inclinado
Después de la esterilización, el medio de agar en el tubo de ensayo se coloca inmediatamente sobre la varilla de madera (o varilla de vidrio) mientras está caliente, y se realiza el gradiente. se completa a tiempo. Después de enfriar, el agar se solidifica formando biseles. La longitud del bisel no debe exceder la mitad del tubo de ensayo.
9. Inspección de calidad
Una vez esterilizado el medio de cultivo, se debe inspeccionar cuidadosamente. Si se descubre que algún tampón está agrietado, empapado en agua, tiene un color anormal o está contaminado con medios, debe desecharse y no puede usarse nuevamente. y determinar su valor de pH final.
También se requiere inspección de esterilidad y efectividad. La prueba de esterilidad consiste en tomar de 1 tubo (frasco) a 2 tubos (frascos) de medio de cultivo estéril e incubarlo a 37 °C durante 1 a 2 días para garantizar que no haya crecimiento de bacterias extrañas; inocular la cepa estándar en el medio de cultivo relevante y verificar la cepa. El crecimiento, la morfología y la bioquímica fueron consistentes con lo que se conoce. Si se cumplen ambas condiciones, se puede utilizar el medio preparado.