En el experimento de extracción de lisozima cruda, ¿por qué se ajustó primero el pH del tampón de clara de huevo a 4,7 y luego a 8,0?
Método de extracción de lisozima:
Pretratamiento de resina: remoje la resina seca en agua para expandirse completamente y eliminar las partículas pequeñas y las impurezas más grandes, agregue 1 mol/L de HCl. Remoje durante 2 horas; enjuagar con agua desionizada tres veces hasta que esté casi neutra; recoger la resina mediante filtración por succión, remojarla en una solución de NaOH de 1 mol/L durante 2 horas y lavarla con agua desionizada tres veces hasta que esté casi neutra filtrar y recoger; resina, agregue un valor de pH de Equilibrar con 6,5 % de tampón fosfato de 0,1,5 mol/L durante la noche para su uso posterior.
Preparación de las claras: lavar y secar tres huevos frescos, hacer un pequeño agujero en el extremo pequeño y un pequeño agujero en el extremo grande para que entre aire, separar las claras y ajustar el pH con 1 mol/L de HCl a 7. Antes de filtrar, pesar 48,7 g en el vaso de precipitado, agitar lentamente, filtrar con dos capas de gasa esterilizada y retirar los trozos de cordón umbilical y las cáscaras de huevo rotas. El peso total de la clara de huevo y el vaso es de 207,5 gramos, y el peso neto de la clara de huevo es de 158,8 gramos. Utilice una solución de HCl de 1 mol/L para ajustar el valor del pH a 7,0 y el volumen de clara de huevo es de 100 ml. Al ajustar el pH aparece una pequeña cantidad de precipitado blanco en la clara del huevo, lo que puede deberse a la desnaturalización de algunas proteínas debido a la acidez local.
Adsorción: Añadir 25g de resina 724 filtrada (equivalente a un cuarto del volumen de clara de huevo) a la clara de huevo con agitación constante, y remover lentamente con un agitador magnético en un baño de agua con hielo (hasta completar completamente). suspender la resina en clara de huevo, sin formar espuma después de agitar), adsorber durante 2,5 h, dejar reposar a 4 °C durante 65438 ± 0,5 h, luego centrifugar a 3000 r/min durante 65438 ± 05 min, colocar capas en capas, recoger la resina y recuperar la clara de huevo (muestra A).
Elimine las proteínas impurezas: enjuague la resina recolectada con agua desionizada hasta que el líquido de lavado esté transparente (hasta que no haya espuma) y succione suavemente las proteínas impurezas del líquido de lavado con una pipeta. (Lavar una vez cada vez, centrifugar una vez, 3 veces en total) En baño de hielo, agitar y lavar durante 15 minutos con el mismo volumen de tampón fosfato 0,15mol/L con pH = 6,5, filtrar y repetir el lavado tres veces, tomando Tenga cuidado para evitar el drenaje de resina. Por última vez, utilice la filtración por succión para filtrar el agua de la resina hasta que se seque.
Elución de lisozima: agregue 35 ml (volumen igual) de solución 10 (NH4) 2SO4 a la resina, revuelva y eluya durante 30 minutos, filtre para eluir la lisozima de la resina, repita dos veces, combine y recoja la eluatos (muestras retenidas). Después de filtrar los eluatos, mida con precisión el volumen de 100 ml. (Retención de muestra b)
Salación: agregue 32 g de (NH4)2SO4 sólido finamente molido a cada 83 ml de eluato. La cantidad total de este experimento es 38,55 g. Agregue lentamente (NH4)2SO4 y revuelva hasta. Disuelva por completo, selle con film transparente y colóquelo en un refrigerador a 4°C para eliminar la sal durante la noche.
Diálisis: Después de separar el precipitado blanco, centrifugar a 3000r/min durante 65438±05min, recoger el precipitado, lavar con agua desionizada hasta su completa disolución (4,5ml de agua desionizada), colocarlo en una bolsa de diálisis, y utilice Dialyze en agua desionizada (baño de hielo), reemplazando el agua desionizada dos veces durante la diálisis hasta que se detecte completamente el BaCl2. Agregue imanes al dispositivo de diálisis y agítelos en un agitador magnético para acelerar la diálisis.
Eliminación de proteínas impurezas: Sacar el dializado de la bolsa de diálisis y ajustar el pH a 4,6 con 0,1mol/L HCl. Se produce una pequeña cantidad de precipitado blanco (muestra D), que puede ser. Proteínas impurezas. Centrifugar a 3000 rpm durante 65,438±00 minutos y recoger el sobrenadante (C 20ul).
Concentración: use PEG-20000 para concentrar el sobrenadante a 1,5 ml (muestra E, 20 ul, agregue tampón de carga, color amarillo (tal vez PEG-20000 penetró en la bolsa de diálisis durante la concentración). [5] [ 6]